PDK-1蛋白在胃癌组织中的表达及临床意义

2019-04-21吴金训

中外医学研究 2019年29期

吴金训

【摘要】目的：研究并分析PDK-1蛋白在胃癌組织中的表达及临床意义，为胃癌的治疗提供新的思路。方法：选取2010年1月-2012年1月于笔者所在医院确诊的82例胃癌患者的癌组织作为观察组，另选取82例健康体检人群正常胃黏膜组织作为对照组。采用酶联免疫吸附法及免疫组化染色法检测PDK-1蛋白在GC组织和正常胃黏膜组织中的表达水平，并分析PDK-1蛋白在胃癌组织中的表达水平与患者各临床病理及PDK-1表达水平与患者预后关系。结果：胃癌组织中的PDK-1表达水平显著性高于正常组织（t=80.36，P<0.01）;观察组PDK-1高表达率显著高于对照组;PDK-1蛋白在胃癌组织中的表达水平与胃癌患者性别无相关性（字2=0.001 1，P=0.93），而PDK-1蛋白与胃癌TMN分期、分化程度、有无淋巴结转移呈显著相关性，且TNM分期越高、肿瘤≥35 mm、分化程度越高、有淋巴结转移，PDK-1高表达率越高;PDK-1低表达组5年生存率及生存期均明显高于PDK-1高表达组（字2=8.713，t=16.108，P<0.01）。结论：胃癌组织中PDK-1表达显著性高于正常胃黏膜组织;PDK-1促进了胃癌的发生、发展;PDK-1高表达与胃癌患者的不良预后相关。PDK-1可能作为胃癌的候选基因和潜在的胃癌生物标志物，深入研究PDK-1具有重要的临床意义。

【关键词】胃癌 PDK-1 预后分析临床意义

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.29.030 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2019）29-00-03

[Abstract] Objective： To study and analyze the expression and clinical significance of PDK-1 protein in gastric cancer， and provide new ideas for the treatment of gastric cancer. Method： The cancer tissues of 82 patients with gastric cancer diagnosed in the hospital from January 2010 to January 2012 were selected as the observation group. The normal gastric mucosa of 82 healthy subjects was selected as the control group. The expression levels of PDK-1 protein in GC tissues and normal gastric mucosa were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and immunohistochemical staining. The relationship between the expression level of PDK-1 protein in gastric cancer tissues and clinical pathology and prognosis of patients were analyzed. Result： The expression of PDK-1 in gastric cancer tissues was significantly higher than that in normal tissues （t=80.36， P<0.01）. The high expression rate of PDK-1 in the observation group was significantly higher than that in the control group. The expression level of PDK-1 protein in gastric cancer tissues was not correlated with the gender of gastric cancer patients （字2=0.001 1， P=0.93）， and PDK-1 protein were significantly correlated with gastric cancer TMN stage， differentiation degree， lymph node metastasis， and the higher the TNM stage， Tumor ≥35 mm， the higher the degree of differentiation， lymph node metastasis， the higher expression rate of PDK-1. The 5-year survival rate and survival time of PDK-1 lower expression group were significantly higher than those of PDK-1 higher expression group （字2=8.713， t=16.108， P<0.01）. Conclusion： The expression of PDK-1 in gastric cancer tissues is significantly higher than that in normal gastric mucosa. PDK-1 promotes the occurrence and development of gastric cancer. The high expression of PDK-1 is associated with poor prognosis of gastric cancer patients. PDK-1 may be a candidate gene for gastric cancer and a potential biomarker for gastric cancer. The in-depth study of PDK-1 has important clinical significance.

[Key words] Gastric cancer PDK-1 Prognosis analysis Clinical significance

First-authors address： Lianjiang County Hospital， Lianjiang 350500， China

胃癌是世界上最常見的胃肠道恶性肿瘤，是全球癌症死亡率的第二大原因[1]。在中国每年大约有一半的胃癌发生率和死亡率。在大多数情况下，胃癌已经发展到晚期，并且在诊断时已经导致转移，因此胃癌的5年生存率较低。鉴定新的潜在的胃癌生物标志物和高风险因子，以及阐明胃癌发生、发展的分子机制具有非常重要的临床意义[2-3]。近年来，越来越多研究表明，磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）的异常激活与多种癌症的发生和发展密切相关，包括乳腺癌、结肠癌和卵巢癌[4]。PDK-1基因的靶向抑制可显著抑制这些癌症的细胞生长[5]。然而，PDK-1基因的异常表达与胃癌的发生、发展及在癌变中扮演了怎样的角色尚不清楚。笔者研究了胃癌患者肿瘤组织中的PDK-1表达，并分析了PDK-1基因的表达与临床病理特征之间的相关性。结果表明PDK-1可能作为胃癌的候选靶基因和潜在的预后生物标志物，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入标准：（1）年龄18～70周岁，性别不限;（2）观察组患者经胃镜及病理组织学确诊为胃癌。排除标准：（1）有严重的精神障碍及神经系统病变;（2）肝肾功能不全，其他恶性肿瘤、胆汁淤积;（3）严重高血压疾病。于2010年1月-2012年1月笔者所在医院收治的82例胃癌患者为研究对象，取患者的胃癌组织作为观察组，82例正常体检人群的正常胃黏膜组织作为对照组。82例胃癌患者中，男40例，女42例，年龄56～81岁，平均（58.3±9.6）岁，病程5～8年，平均（6.73±2.10）年。对照组男43例，女39例，年龄55～80岁，平均（58.6±9.2）岁。两组性别、年龄等一般资料差异无统计学意义（P>0.05）。本研究经笔者所在医院医学伦理委员会审批，所有患者（或患者直系亲属）均签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂

超净工作台（苏州安泰）、PDK-1 Elisa 试剂盒（上海瓦兰生物）、全自动酶标分析仪（北京普朗）、兔抗人PDK-1多克隆抗体（上海信裕生物）、SP染色试剂盒、DAB显色试剂盒、苏木素染色剂（盖德化工）。

1.3 Elisa法测定PDK-1蛋白含量

将少量组织块置于1.5 ml离心管中，加入500 μl含PMSF的强RIPA裂解液，先用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，接着用1 ml枪头不断地吹打吸取，用匀浆器打碎组织，最后用超声仪进行超声裂解;将离心管置入4 ℃离心机，12 000 r/min离心25 min，取上清分装于1.5 ml离心管中并置于-80 ℃保存，采用Elisa法测定上清中PDK-1的含量。

1.4 免疫组化法测定PDK-1的表达水平

胃癌组织和正常样品在4%中性磷酸盐缓冲的福尔马林中固定并包埋在石蜡中，在脱蜡后，将内源性过氧化物酶在3%的H2O2中封闭20 min。将组织切片切成5 mm厚，用于随后对PDK1蛋白的免疫组织化学染色。通过将样品在10 mmol柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中于95 ℃加热60 min来进行抗原修复。在室温下用Block Ace处理30 min后，将PDK-1按1∶500的稀释度加到切片上，4 ℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育30 min，加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物，切片用苏木精复染，封片。免疫染色由两位不同的病理学家评估。PDK-1蛋白表现为细胞内出现棕黄色颗粒。免疫组织化学染色根据染色强度的视觉分级为低（+）或高（+++）。

1.5 评价标准

均按照世界卫生组织标准分类，TMN分期按照UICC标准，病理特征按照胃癌的Lauren分型来确定。

1.6 统计学处理

数据分析用SPSS 18.0系统;计量资料以（x±s）表示，并采用t检验;计数资料以率（%）表示，采用字2检验;PDK1蛋白水平与胃癌患者预后采用Kaplan-Meier生存曲线分析，生存率的比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDK-1在胃癌组织及正常组织中的表达水平比较

胃癌组PDK1蛋白表达水平为（63.57±5.12） ng/g，高于正常组织的（13.48±3.28） ng/g，差异有统计学意义（t=74.6，P<0.01）。

2.2 PDK-1在观察组和对照组中表达情况比较

PDK-1蛋白在胃癌组织和正常组织中的高表达率分别为87.8%、56.1%，差异有统计学意义（字2=20.42，P<0.01），见表1。

2.3 PDK-1表达与临床病理参数相关性

PDK-1表达与性别无相关性（P>0.05），而与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、TMN分期显著相关（P<0.01），见表2。

2.4 PDK-1蛋白表达水平与胃癌患者预后

PDK-1低表达组5年生存率与PDK-1高表达组5年生存率（90.0% vs 50.0%）及PDK-1低表达组生存期与PDK-1高表达组生存期[（54.2±2.14）个月] vs [（33.8±2.96）个月]差异均有统计学意义（字2=8.713，t=16.108，P<0.01），见图1。

3 讨论

胃癌是最致命的恶性肿瘤之一，超过50%的晚期恶性肿瘤患者在确诊时发生远处转移。虽然胃癌的临床治疗取得了进展，然而，这种恶性肿瘤的耐药性和发展迅速性在某种程度上阻止了胃癌的治疗效果。在目前的研究中，发现PDK-1在胃癌组织和相邻的非肿瘤组织中的转录和翻译水平上存在显著差异。另外，发现PDK-1的表达与患者存活率高度相关，PDK-1高表达患者术后生存率显著低于PDK-1表达的患者。笔者认为PDK-1可能在胃癌的发展中起重要作用，可以作为胃癌的潜在的预后生物标志物。

研究证明，PDK-1是丝氨酸/苏氨酸激酶，属于蛋白激酶家族的成员，其催化结构域与cAMP依赖性蛋白激酶1以及蛋白激酶C有同源性[6-7]。作為磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT/PKB）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mlOR）信号传导通路的第一个节点，PDK-1涉及一系列磷酸化过程，PDK-1的组成型表达通常由其他激酶调节，然后在第308位苏氨酸处进行AKT的磷酸化，AKT激活所必需的。确实，胃癌基因突变多方面的研究已经暗示了这一点，PI3K/Akt/mTOR通路作为胃癌发展过程的重要的一部分[8-10]。据报道，74%和78%的胃肿瘤表现出Akt和磷酸化Akt（p-Akt）表达水平的升高[11-12]。该p-Akt在促进各种分子功能，如细胞周期进展和血管生成已经得到广泛的研究。血管生成是肿瘤转移的重要组成部分，它可以募集新的血管，促进肿瘤细胞从原发部位进入血液。笔者的数据显示PDK-1的表达和临床病理参数及胃癌的严重程度显著相关，暗示PDK-1发挥作用在胃癌的发展过程发挥着重要作用。总之，笔者研究了PDK-1在胃肿瘤患者和健康体检者中的表达，随后研究了其表达水平与患者预后和生存之间的关系。在目前的研究中，笔者发现胃癌组织和健康体检者的PDK-1表达存在显著差异;此外，笔者发现PDK-1的高表达促进了肿瘤的生长、转移、分化;PDK-1的高表达与胃癌患者的不良预后相关，笔者推测PDK-1可能在胃癌的发展中起重要作用，并且有望成为胃癌诊断的生物标志物。

参考文献

[1]靳枫，余少康，王树滨，等.miR-424在胃癌组织中的表达及其临床意义[J].中国医学创新，2019，16（7）：126-129.

[2]陈素梅，李芳芳，张丽萍.胃癌癌前病变临床分析[J].中国医学创新，2014，11（35）：116-118.

[3]邵长明，邵钦树.胃癌组织中microRNA-224阳性表达与患者预后相关性分析[J].中外医学研究，2016，14（27）：1-3.

[4]申力，郝友进，罗钱春，等.葱蝇PDK1基因的克隆及生物信息学分析[J].重庆师范大学学报：自然科学版，2014，31（1）：30-36.

[5]王永峰，高恒瑞，张红鸽，等.3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1小干扰RNA对人胃癌BGC823细胞增殖和凋亡的影响[J].中华实验外科杂志，2016，33（2）：331-333.

[6]张颖，孙志鹏，余春开，等.胃癌患者癌组织中PDK-1蛋白表达水平及其临床意义[J].中国煤炭工业医学杂志，2018，21（3）：298-303.

[7]刘田田，毕经旺.3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1在肿瘤发生发展及治疗中的作用[J].国际肿瘤学杂志，2016，43（4）：285-288.

[8]张俊萍，赵一，梁瑞峰，等.化瘀解毒方对过表达PDK1和Akt人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响[J].辽宁中医杂志，2017，44（5）：1036-1039.

[9]英舟，万义增，陈素贤.miR-138靶向调控PDK1基因抑制人结肠癌SW620细胞侵袭[J].肿瘤防治研究，2016，43（5）：340-344.

[10]于婧，王凤琴，姚文娟，等.结直肠癌组织中PDK1、Bcl-2、survivin 表达变化及意义[J].山东医药，2015，55（30）：34-36.

[11]宋世铎，周健，何宋兵，等.miR-375和PDK1在胰腺癌组织中的表达及两者的相关性[J].肿瘤防治研究，2013，40（8）：728-732.