纤维素分解菌的分离筛选及特性研究

2019-04-20杨伟平郭雷锋

中国畜牧杂志 2019年4期

杨伟平，郭雷锋，赫倩

（洛阳师范学院生命科学学院，河南洛阳 471934）

农作物秸秆作为农业生产的副产品，是我国重要的生物资源[1]。2016年我国农作物秸秆产量达81 565.30万t[2]，但因含有大量木质素导致很难被充分利用。目前，秸秆虽然作为燃料、饲料和肥料和造纸工业的原料被利用，但当前农作物秸秆焚烧量依然占27%[2]。

纤维素分解菌具有降解纤维素的能力，在提高秸秆利用效率方面具有一定的市场前景。王加友等[1]利用从土壤中分离到的1株纤维分解菌SY-403对玉米秸秆处理40 d时，秸秆的纤维素分解率达55.26%。美合热阿依·木台力甫[3]将2株乳酸菌与2株纤维素分解菌等比例混合后作为添加剂进行青贮发酵，发酵饲料的品质明显提高，动物对干物质和中性洗涤纤维的消化率也显著增高。黄旺洲[4]将分离到的纤维素分解菌群用于猪粪和牛粪的堆肥，发现纤维素分解菌群不仅能脱水、控制发酵过程的pH、使粪便中粗纤维和有机质被有力分解和降解，也可抑制粪便中NH3及H2S的释放。

鹅是草食性动物，不仅具有发达的盲肠，其肠道内也存在着大量微生物，在利用粗纤维方面具有较大优势[5]。本试验以鹅的新鲜粪便为材料，分离筛选高效降解纤维素的细菌并研究其特性，为动物微生态制剂、生物堆肥和除臭剂研究提供菌种资源和基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品的采集本试验中所用鹅的新鲜粪便采集于洛阳师范学院伊滨校区月明湖畔。采集粪便时，除去其表面的杂草和泥土，取中间部分，装封口塑料袋中，排气封口，编号，放入干净的泡沫盒中在短时间内带回实验室并进行纤维素细菌的分离。用于除臭试验的鸡粪便采集于洛阳市伊滨区某养鸡场。

致病性大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为洛阳师范学院生命科学学院动物营养与健康调控研究室所保存。

1.2 培养基配制纤维素分解菌的分离筛选培养基及发酵培养基、LB培养基的配制见文献[6]。

1.3 仪器主要设备为莱卡正置荧光显微镜、BIOTEK Synergy H1型酶标仪、台式高速冷冻离心机、Eppendorf PCR扩增仪、恒温培养箱、凝胶成像分析仪、立式高压蒸气灭菌锅等。

1.4 纤维素分解菌的初筛[6]称取1.0 g鹅的新鲜粪便，转移至一灭菌的三角瓶中，加入无菌水至100 mL刻度处，在80℃恒温水浴锅中振荡30 min，即为粪便内容物10-2的稀释液，将此液继续进行梯度稀释，然后涂板、培养、刚果红染色[7]，最后挑取菌落周围透明圈直径（D）和菌落直径（d）比值大的菌落，接种至无菌的LB液体培养基中培养，然后在LB+1%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）的平板上划线分离纯化培养2～3代，将纯化后的菌种转至斜面LB固体培养基培养后，4℃保存备用。

1.5 纤维素分解菌的复筛将初筛纯化后的纤维素分解菌的菌液浓度调至OD600为0.5左右，按1%接种量接种于基础发酵培养基中，37℃，160 r/min振荡培养28 h，5 000 r/min、4℃条件下离心发酵液15 min，其上清液即为粗酶液，最终以测得的羧甲基纤维素酶（CMCase）活性高低作为复筛纤维素分解菌的标准。

CMCase活力的测定参照《饲料添加剂纤维素酶活力的测定》（NY/T 912-2004），即分光光度法测定饲料添加剂中纤维素酶活力。其中，CMCase的酶活力单位用U/mL表示，定义：CMCase与底物CMC-Na在pH 5.5、40℃条件下反应30 min，每分钟由底物CMCNa降解产生1 μmol还原糖所需的酶量。

1.6 纤维素分解菌的鉴定方法

1.6.1 形态学鉴定采用革兰氏染色法，观察分离到的纤维素分解菌在显微镜下的形态和染色特征，染色方法参照钱存柔等[8]的方法进行。

1.6.2 纤维素分解菌的16S rRNA基因鉴定 CTAB/NaCl法提取细菌基因组DNA[9]，然后以细菌基因组DNA为模板，使用细菌通用引物27F/1492R进行细菌16S rRNA基因扩增。PCR反应体系（25 μL）：DNA模板 1 μL（50～100 ng/μL），上、下游引（10 pmol /μL）物各 1 μL，2×PCR Master Mix 酶 12.5 μL，无离子水补足至25 μL。PCR扩增条件：95℃预变性3 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，50 s；30个循环；72℃延伸5 min。1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测目的基因。将检测正确的PCR产物送至北京中科希林生物科技有限责任公司进行测序。测序结果在NCBI上用BLAST程序与GenBank中16S rRNA基因序列进行同源性分析。用Mega5.1中的邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育树。

1.7 纤维素分解菌的特性研究

1.7.1 耐热性[6]将培养至24 h的纤维素分解菌（OD600=0.5）分别置于55、65、75、85℃水浴中处理30 min后用流水迅速冷却，以未经过热处理的菌液作为对照，采用平板计数法，根据其存活率评价纤维素分解菌的耐热能力。

1.7.2 抑菌特性将试验用的纤维素分解菌液（OD600=0.5）以1%接种量接种至100 mL LB液体培养基中，37℃160 r/min震荡培养30 h后，12 000 r/min离心2 min，上清液备用。抑菌试验采用牛津杯法[6]。

1.7.3 除臭特性称200 g新鲜的鸡粪便置于干净的塑料瓶中，以5%的接种量向瓶中添加浓度为1.0×108CFU/mL的纤维素分解菌、搅拌均匀，作为试验组，每组做3个平行。试验前排出发酵瓶中多余气体，将集气管一端连接装粪便的瓶子（集气管连接处密闭），另一端连接一定体积的集气袋收集气体，然后置于37℃的水浴锅中发酵10 h并收集气体。对照组以无菌水代替纤维素分解菌。试验中NH3和H2S产量的测定分别采用纳氏分光光度法《公共场所卫生检验方法第2部分：化学污染物》（GBT-18204.2-2014）和《天然气中硫化氢含量的测定碘量法 GB/T 11060.1-1998》进行，并计算该纤维素菌对鸡粪便所产NH3和H2S的去除率。

1.8 统计分析采用Excel整理试验数据，采用SPSS 19.0统计分析软件中Dancan´s法进行多重比较。

2 结果

2.1 纤维素分解菌的筛选采用刚果红染色法初筛，发现在来自鹅粪便中的多株菌的菌落周围都产生了清晰的透明圈。进一步将初筛到的菌株反复划线纯化培养、刚果红染色，比较不同菌株菌落的形态大小、D/d值以及CMCase活性，最终确定将编号为G-6、D/d值为4.8（透明圈直径为2.4 cm、菌落直径为0.5 cm）以及CMCase为0.37 U/mL的纤维素分解菌用于后续试验（图1）。

图1 试验菌株G-6在CMC-Na板上的水解圈

2.2 菌株G-6的鉴定

2.2.1 形态学鉴定通过反复分离纯化培养发现，菌株G-6为乳白色，大小均一、表面有褶皱，周边呈锯齿状结构（图2A）。革兰氏染色阳性、杆状，且有芽孢（图2B）。

图2 菌株G-6的形态特征和革兰氏染色结果

图4 菌株G-6 16S rRNA基因序列的系统发育树

2.2.2 16S rRNA 基因鉴定以试验菌株G-6基因组DNA为模板，进行16S rRNA基因的PCR扩增，1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测后得到1 500 bp的目的条带，其大小与预期结果基本一致（图3）。将测序结果在NCBI里用BLAST程序对试验菌株的16S rRNA基因序列进行比对，通过Mega6.0构建的系统进化树进行同源性分析发现（图4），该试验菌株为芽孢杆菌属的甲基营养性芽孢杆菌，命名为 Bacillus methylotrophic strain G-6。

2.3 Bacillus methylotrophic strain G-6的特性

2.3.1 耐热性通过耐热试验发现（表1），随着温度的升高，Bacillus methylotrophic strain G-6的存活率呈下降趋势，但仍表现出较强的耐热性。其中Bacillus methylotrophic strain G-6在55℃和65℃时的存活率显著高于75℃和 85℃（P＜0.05）。

图3 菌株G-6 的16S rRNA基因琼脂糖凝胶电泳图

表1 Bacillus methylotrophic strain G-6的耐热性（n=3）

2.3.2 抑菌特性通过抑菌试验（图5）可知，Bacillus methylotrophic strain G-6对2种致病菌均表现出了一定的抑菌作用。其中，该试验菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为13.63、16.17 mm。显著性分析表明，该菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性差异显著（P＜0.05）。

2.3.3 除臭能力由表2可知，对照组粪便中H2S和NH3的产量分别为18.64、79.3 g/m3，而试验组则分别为7.86 、56.14 g/m3，极显著低于对照组（P＜0.01）。进一步分析表明，Bacillus methylotrophic strain G-6对鸡粪便H2S、NH3的去除率分别达57.8%、29.26%。

图5 Bacillus methylotrophic strain G-6的抑菌图

表2 Bacillus methylotrophic strain G-6对H2S和NH3的去除效果（n=3）

3 讨论

3.1 纤维素分解菌的分离普通固体培养基中添加CMC-Na、结合刚果红染色法分离筛选纤维素分解菌，因简单快捷、成本低等优点被广泛采用[10]。但CMC-Na平板筛选法因不能定量反映纤维素分解菌产CMCase的真实能力，需用菌株进行液体发酵，根据其产纤维素酶活的高低进行复筛[11]。本试验筛选出了1株具有高效降解纤维素的菌株G-6，最终被鉴定为芽孢杆菌属的甲基营养性芽孢杆菌，命名为Bacillus methylotrophicus G-6。以LB+1%CMC为基础发酵培养基进行发酵培养，Bacillus methylotrophicus G-6纤维素酶活性高达0.37 U/mL，低于张盼等[12]从土壤中以及关怡等[13]从森林公园下的湿润木屑中分离到的纤维素分解菌，高于王彦伟等[14]从竹虫幼虫的肠道中分离到的纤维素分解菌的产酶能力。诸多研究发现，纤维素分解菌CMCase活性大小不仅与菌种及来源、培养基成分、发酵培养时间、测定采用的标准方法等因素有关[12-15]，还与纤维素酶的酶反应条件（如底物和发酵酶液的浓度、温度、时间、种子液浓度、接种量等因素）有关[15]。

3.2 Bacillus methylotrophicus G-6的特性目前，甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）主要用于作物病害防治[16]、生物表面活性剂[17]等方面的研究。此外，谭泽文等[18]研究发现从土壤中分离到的甲基营养型芽孢杆菌对餐厨垃圾具有防蝇产蛆效果。但该菌用在生物堆肥及除臭的研究上还很少。徐杰等[19]将分离到的甲基营养型芽孢杆菌L1和枯草芽孢杆菌X9、解淀粉芽孢杆菌L8组成复合菌剂后用于牛粪的堆肥，结果显示复合菌剂不仅对木质纤维素有一定降解能力，而且具有使堆肥快速升温和有效除臭的潜力。

本研究中，发现Bacillus methylotrophicus G-6菌株能耐受一定高温，在55℃条件下其存活率达到90%以上，并且其代谢产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。此外，研究表明，NH3的挥发主要在堆肥前期（即升温和高温期）[20]，而H2S气体的释放量在不同动物粪便堆肥中释放的早晚不同[21]。本试验中，鸡粪便在处理过程中NH3和H2S的产生与任顺荣等[22]的研究结果基本一致，即初期H2S产量少，而NH3产量大。Bacillus methylotrophicus G-6对鸡粪中H2S和NH3的去除率分别达57.81%和29.26%，低于张宏才等[23]从鸡粪便中分离到的红平红球菌对NH3和H2S的去除率，但高于许启有等[24]从猪粪便中分离到的短状杆菌属细菌X-3d等对NH3和H2S的去除率。由此可见，除臭菌的除臭效果不仅与其菌种及来源有很大关系，还与发酵初始pH、培养温度及菌种接种量等有一定关系[23]。