β-葡萄糖苷酶抗体的制备及比较分析

余厚美，张振文

(中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所/国家薯类加工技术研发分中心/农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室，海南 儋州 571737)

β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC3.2.1.21)是一种水解酶，也叫β-D-葡萄糖苷水解酶、龙胆二糖酶[1]，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基[2]，相对分子质量一般在40×103～250×103之间。1837 年， LIEBIG和 WOHLER首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶，其广泛存在于许多古细菌、细菌、真菌、酵母、曲霉、昆虫、动物和植物中[3-5]。不同来源的β-葡萄糖苷酶的相对分子质量差异较大，这是由其结构和组成的不同导致的。由于参与生物体的糖代谢，β-葡萄糖苷酶对维持生物体的正常生理功能有着重要作用[2]，已经在哺乳动物的疾病防治和人类的癌症治疗方面广泛开展了应用研究[2,6]；此外，β-葡萄糖苷酶还能将果、蔬、茶中的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质，协助纤维素酶降解纤维素等功能[1-2,7-8]，在饲料工业、生物合成和生物燃料等领域，β-葡萄糖苷酶同样有巨大的应用价值[4,9]。目前，β-葡萄糖苷酶的检测技术主要是酶活法，主要测试方法有分光光度法、荧光法、电化法和比色法[8]和以京尼平苷为底物检测酶活的一种新方法[10]。分光光度法容易受到干扰，灵敏度低；荧光法灵敏度高，但是操作复杂，重复性差[11]。比色法虽然灵敏度不如以京尼平苷为底物的方法高，但是总体来说，简单、快速、重复性好[8，11]。酶联免疫法(ELISA)是免疫学领域应用最广泛的技术之一，是将免疫学技术与现代测试手段相结合而建立的一种超微量的检测技术。ELISA的优点是检测成本低、可大批量检测、专一性强、灵敏度高、安全性好，可进行定性或者定量检测，不需要昂贵的仪器，操作简单，容易推广普及，尤其适合样本量大、检测种类多的现场和基层检测[12-14]。免疫学分析技术主要利用抗原抗体的特异性结合，已广泛应用于生命科学的各个研究领域。近年来免疫学分析技术以其抗原抗体反应的高度专一性和特异性，在人类临床诊断、食品安全等领域 广泛应用[15]。

1 材料与方法

1.1实验材料以β-葡萄糖苷酶为抗原，该抗原分别购自北京索莱宝公司、上海源叶生物公司、上海麦克林公司(表1)；DMEM不完全培养基购自北京索莱宝公司； HAT、HT、DMSO、小鼠抗体亚型鉴定试剂盒、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)为Sigma公司产品；QuickAntibody-mouse 5w佐剂、clone easy培养基购自北京博奥龙免疫技术有限公司；弗氏佐剂、HRP-羊抗鼠、PEG融合剂、TMB底物液、封闭液和抗体稀释液购自海南亿康生物科技有限公司；胎牛血清、小牛血清购自兰州民海生物公司；Tween-20、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氯化钾和甘油等化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司； Babl/C小鼠购自汕头大学医学中心；SP2/0保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家薯类加工技术研发分中心实验室。

表1 不同厂家的抗原信息

1.2动物免疫将不同厂商生产的β-葡萄糖苷酶分别编号为A，B，C， 按每鼠50 μg的剂量与QuickAntibody-mouse 5w佐剂等剂量混匀，后腿肌肉注射免疫4只小鼠，第21 天按同样方式再免疫 1 次，第35 天断尾采血，全血37 ℃ 放置 2 h后4 ℃ 放置12 h，4 ℃ 10 000 r·min-1离心15 min，收集血清，每只小鼠血清都用A，B，C 3种蛋白作为包被原，ELISA间接法检测血清效价。

1.3单克隆抗体的制备取50 g 免疫原用生理盐水定容到500 μL，腹腔冲击免疫抗体效价高的小鼠，冲击免疫后72 h 左右摘眼球取全血分离血清保存，备用。将小鼠在体积分数为75%的酒精中浸泡10 min，无菌条件下取出小鼠脾脏并分离脾细胞，与 SP2/0 细胞在 PEG 作用下融合，HAT 筛选培养，培养7～10 d ，以免疫原为包被原，用上述间接ELISA 检测细胞上清，阳性细胞用有限稀释法克隆直至阳性单克隆率为 100%，小鼠体内诱生腹水法制备抗体，将阳性杂交瘤细胞于液氮中长期保存[13]。

1.4腹水纯化参考欧文军等方法[15]并加以改进，将新采集的腹水于4 ℃、10 000 r·min-1离心15 min，去沉淀，用0.05 mol·L-1、pH7.0的PBS 5倍稀释，在冰浴条件下等体积逐滴加入饱和硫酸铵溶液，冰浴搅拌30 min后4 ℃静置12 h，4 ℃、10 000 r·min-1离心15 min，弃上清，沉淀用与腹水等体积的0.02 mol·L-1、 pH 7.2 的PBS溶解，冰浴条件下再逐滴加入总PBS体积半量的饱和硫酸铵溶液使之达到33%饱和度，连续搅拌30 min后4 ℃、10 000 r·min-1离心15 min，弃上清，沉淀用0.02 mol·L-1、pH 7.2 的PBS透析72 h后分装，- 20 ℃冻存。每个抗体纯化前后各取10 μL，用SDS-PAGE对抗体进行电泳，考马斯亮蓝染色检测纯化效果。

1.5抗体效价和特异性检测采用棋盘法测定抗体效价，即抗原用pH 9.6，0.05 mol·L-1的碳酸盐缓冲液稀释，按照100 ng·mL-1，200 ng·mL-1，500 ng·mL-1，1 μg·mL-1，2 μg·mL-1，5 μg·mL-1的浓度梯度包被于酶标板，每孔100 μL，37 ℃ 包被2 h，PBST 洗涤1次，每孔用120 μL含5% 小牛血清的PBST，37 ℃封闭1.5 h，每孔加100 μL梯度稀释的抗体，37 ℃反应30 min，PBST洗涤 4～5 次，每孔加100 μL酶标羊抗鼠二抗，37 ℃反应30 min，PBST 洗涤4～5 次，TMB底物液37 ℃显色反应15 min，0.5 mol·L-1H2SO4终止反应后，酶标仪450 nm波长处检测每孔的吸光度值。选择阳性孔OD值大于阴性OD值的2.1倍的抗体最高稀释倍数为抗体的效价。然后分别在酶标板上包被1 μg·mL-1Aβ-葡萄糖苷酶、Bβ-葡萄糖苷酶、Cβ-葡萄糖苷酶、KLH、BSA，采用ELISA方法检测抗体的特异性。

1.6抗体亚型鉴定用小鼠抗体亚型鉴定试剂盒检测单抗的亚型。

1.7电泳鉴定3种β-葡萄糖苷酶抗原分别取20 μg ABC 3种抗原，用SDS-PAGE对抗原进行电泳，考马斯亮蓝染色。

2 结果与分析

2.1抗原SDS-PAGE鉴定抗原相对分子质量大小对免疫结果至关重要。本研究将3种抗原进行SDS-PAGE电泳鉴定，结果见图1。由图1可见，3种抗原电泳条带差异明显。A、B抗原在250×103附近有条带出现，但是出现位置不同，C抗原在该区域没有条带出现；3个抗原在95×103附近都有条带出现，但是出现位置几乎不重复，B抗原在95×103附近只有1条带，A、C抗原均有2条带；B、C抗原在55×103～72×103间有1个比较粗的蛋白条带出现。在所有蛋白里面， B抗原条带最多。

表2 小鼠血清效价检测

2.2小鼠血清效价检测用免疫前的小鼠血清作为阴性对照，抗原包被5 μg·mL-1，12只小鼠血清分别梯度稀释，得到的血清效价见表2。A免疫原免疫的小鼠只对A抗原显色，对B，C抗原不显色，B和C免疫的小鼠也出现和A抗原免疫的小鼠一样的情况，即只对本身免疫原显色，对其余抗原均不显色。挑选A抗原效价高的2#小鼠进行细胞融合。

2.3抗体纯化前后效价测定和SDS-PAGE对比融合共铺板8块96孔板，融合细胞孔阳性率为1%，融合后的杂交瘤细胞经过3次的有限稀释克隆，得到5株阳性单克隆细胞。5株阳性单克隆细胞体外诱导法制备的腹水的效价均达到105及以上，结果见表3。纯化前后进行SDS-PAGE分析，结果见图2，纯化后的抗体条带主要集中在25×103和55×103附近，纯化后杂质明显少于纯化前，效价有所下降，但是变化不大，说明抗体纯化保留了抗体的有效成分，成功去除了杂质，达到了纯化的目的。

2.4抗体纯化后亚型测定和特异性测定将所有纯化的抗体加入事先包被好的β-葡萄糖苷酶A 抗原、B 抗原、C 抗原、KLH、BSA板孔检测抗体的特异性，结果(表4)表明，所有抗体均与B 抗原、C 抗原、KLH、BSA无交叉反应，说明抗体均为A 抗原特异性抗体。通过抗原抗体特异性结合把抗体固定在酶标板上，加亚型抗体测定的单克隆抗体亚型均为IgG1型。

表 3 腹水纯化前后效价检测

表 4 纯化后抗体特异性和抗体亚型测定

3 讨 论

抗原抗体反应是免疫应答的基础[16]，抗体是免疫分析技术的核心试剂[18]。机体产生抗体的强度，受到动物物种、年龄、体质状况、免疫部位、抗原结构、抗原性质、抗原剂量、佐剂、免疫途径、间隔时间等因素的影响[18]。本研究使用的小鼠年龄、注射方式、注射剂量、免疫部位等完全一样的情况下，所用的3 个β-葡萄糖苷酶均标注来自于杏仁，分别免疫后的抗体只对相应原免疫原显色，对其不同来源免疫源都不显色。即A免疫的小鼠所得血清，只对A抗原显色，对B、C抗原均不显色；B免疫原和C免疫原免疫动物检测结果A相同，都只对免疫原显色，对其余抗原均不显色。首先验证是不是抗原活性原因引起的差异，所以要求厂商分别做质控，但是反馈质控活性正常；又分别购买同一生产厂商其他货号的产品，检测所得的结果和免疫原相似，即同一厂商的不同货号和批次的蛋白均对从该厂商采购的β-葡萄糖苷酶为免疫原免疫的鼠产生的抗体显色，对其余抗体不显色，即A免疫的小鼠所得血清，只对A厂商来源的抗原显色，对B、C抗原均不显色，只是不同批次和货号间效价有差异；B和C免疫后也得到相同的结果。本研究中，3个不同来源抗原经电泳分析表明其相对分子质量差别较大，A和B、C抗原条带几乎没有重叠，所以产生的抗体间无交叉反应，B、C抗原在55×103～72×103间有2个相似的条带，但是B、C抗原免疫动物后，抗体检测结果表明抗原间仍然没有交叉反应。可见，不同来源的抗原均产生了特异性抗体。β-葡萄糖苷酶免疫小鼠产生抗体差异如此大，可能是跟β-葡萄糖苷酶的蛋白结构差异有关，因为不同来源(即使是同一菌属的不同菌株或者同一植物组织)的β-葡萄糖苷酶的相对分子质量差异40×103～250×103的范围[2]，而且有单亚基、多亚基的区别，其结构差异就有可能大相径庭[19]。

不同的结构有不同的空间构象，抗体的产生是抗原刺激机体产生的免疫反应，不同构象的抗原免疫，肯定得到不同的抗体，这也是不同厂商来源的β-葡萄糖苷酶差异巨大的原因之一。此外，有研究表明，不同来源(化学合成、不同克隆表达产物、自然感染表达等)的同一生物分子的抗原存在差异，抗原中单个氨基酸替代突变所致抗原性的序贯漂移和抗原不稳定等因素都对抗原抗体的结合产生很大的影响[20]。甚至在仅有一个氨基酸差异或仅为几个小分子DNP的情况下，也会出现与抗体结合的情况，使之能逃避宿主的免疫应答、抗体效价相差巨大的情况出现[16，21]。为此，避免因抗原来源不同导致产生特异性抗体，开展同一来源的抗体制备是解决出现特异性抗体的关键，也是今后研究的重点。