RANKL/OPG系统及白细胞介素8在炎症性肠病中的表达及作用研究

杨贝贝， 王许平， 王丹丹， 耿 丽， 杜晓博， 高 闯， 王斌斌， 冯百岁

郑州大学第二附属医院消化内科 郑州大学第二附属医院炎症性肠病中心 吴阶平医学基金会中国炎症性肠病联盟 河南省炎症性肠病中心，河南 郑州 450014

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一类病因不清的慢性非特异性胃肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crhon’s disease, CD)[1-2]。近年关于IBD的研究有了显著进展，但IBD的确切发病机制尚不清楚[3]。

肿瘤坏死因子(TNF)超家族参与包括免疫、炎症、细胞增殖、分化和凋亡的过程[4]。TNF超家族成员是具有广谱活性的因子，包括直接破坏肠上皮屏障完整性和共刺激淋巴细胞的促炎作用。其中TNF-α是迄今已在该家族中鉴定的19种不同配体和29种受体的创始成员，在IBD中具有确定的病理学作用，目前也作为IBD治疗的靶标[5]。

核因子-κB受体活化因子配体(RANKL又称TNFSF11)是TNF超家族成员之一，有研究报道，其受体核因子-κB受体活化因子(RANK)和骨保护素(OPG)是IBD中肠道炎症和骨稳态的潜在系统[6-7]。TNFSF11通常由活化的T细胞和树突状细胞产生[8-9]，由于TNFSF11由炎症细胞产生，并且在不同的促炎细胞因子如TNF-α和IL-6的控制下释放，因此RANKL/RANK/OPG系统与肠道炎症之间存在一定联系。

骨保护素(OPG又称TNFRSF11b)是TNF受体超家族的可溶性成员，主要来源于成骨细胞、巨噬细胞、B细胞和单核细胞[7]，是抑制破骨细胞分化和活化的关键因子。研究证明，OPG具有促炎作用和TNF-α样活性[10]，认为OPG可作为IBD的疾病标志物。TNF-α可通过过度激活经典NF-κB途径诱导肠黏膜屏障功能障碍[11]。在未受刺激的细胞中，NF-κB大多数处于与其抑制剂IκB结合的无活性状态。在接受刺激后，IκB蛋白被称为Iκκ-a和Iκκ-b的IκB激酶(Iκκ)复合物快速磷酸化，促进IκB的降解。解除抑制剂的NF-κB，进而激活NF-κB的核转位，在细胞核中，NF-κB与DNA的启动子区域结合并导致靶基因转录的上调或下调[12-13]。OPG以TNF-α类似的方式诱导Iκκ-a的磷酸化，进而诱导NF-κB活化，相关炎症因子IL-8的分泌增加，进一步促进炎症反应。

IL-8又称CXCL8,是C-X-C趋化因子家族的一员，与其受体IL-8Rα和IL-8Rβ结合可以趋化炎性细胞如淋巴细胞和嗜中性粒细胞[14]，IL-8的黏膜生成增加会吸引嗜中性粒细胞从循环进入炎症部位，并诱导间质组织中的嗜中性粒细胞结合，从而促进受影响的IBD黏膜嗜中性粒细胞的积聚和活化，进而加重炎症反应[15]。

研究表明，C-反应蛋白(CRP)及红细胞沉降率(ESR)可作为IBD炎症标志物反映炎症进程[16-17]，本文分析IL-8与CRP、ESR的相关性，检验IL-8是否有望成为IBD的新型炎症标志物。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2016年9月至2018年4月郑州大学第二附属医院住院IBD患者38例，包括UC患者28例，男15例，女13例，年龄(45.3±15.8)岁(18～69岁)；CD患者10例，男4例，女6例，年龄(33.4±11.2)岁(15～55岁)。同期20名健康体检者血清为对照组，男8名，女12名，年龄(33.8±11.7)岁(18～55岁)。同期于我院行结肠癌手术切除癌旁组织24例作为癌旁组，男15例，女9例，年龄(49.1±13.7)岁(25～71岁)。所有成员年龄及性别分布差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。诊断标准参照《炎症性肠病诊断与治疗共识意见(2018，北京)》[18]，入选对象均排除受试前3个月内接受非甾体类抗炎药、免疫调节剂、免疫抑制剂或生物制剂治疗，或合并其他自身免疫性疾病者。收集IBD患者的CRP及ESR值，为同一时间检查结果，排除时间引起差异。本研究方案经郑州大学第二附属医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂RANKL小鼠抗人单克隆抗体购自Abcam公司，OPG兔抗人多克隆抗体购自博奥森生物技术有限公司；免疫组化试剂盒(兔增强聚合物法检测系统PV-9001和小鼠增强聚合物法检测系统PV-9002)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3标本收集结肠黏膜组织为IBD患者结肠镜下黏膜活检，癌旁组为结肠癌手术切除距癌组织5 cm及以上的癌旁正常组织。血清采集方法：外周静脉采血4 ml，18～25 ℃室温静置20 min，于4 ℃以3 000 r/min离心15 min，收集上层血清，每管分装1 ml，于-80 ℃保存待测。

1.4结肠组织标本中RANKL及OPG的检测切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。经去离子水及磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，在质量浓度为30 g/L H2O2内源性过氧化物酶灭活15 min。将载玻片置于抗原揭膜溶液中经高压灭菌行高温抗原修复15 min，后冷却至室温。经山羊血清避光封闭30 min。用灭菌PBS稀释抗RANKL(1∶200， 5 μg/ml)、抗OPG(1∶600，1.7 μg/ml)。滴加一抗，4 ℃过夜。经免疫组化试剂盒酶标二抗孵育10 min和增加剂孵育10 min。应用DAB显色试剂盒染色，苏木素复染，质量浓度为10 g/L盐酸酒精分化，各步骤之间用PBS洗涤3次，每次5 min。经梯度酒精和二甲苯脱水、透明，中性树胶封片并永久保存。阳性结果判定[19]：高倍镜(400×)下于无组织重叠、卷曲，无顶端效应等影响结果区域，选择5个不重复视野观察，每个视野计数50个细胞。阳性细胞百分比：0～25%计0分，26%～50%计1分，51%～75%计2分，>75%计3分。染色深度：轻度计1分，中度计2分，重度计3分。阳性细胞百分比计分与染色深度得分之和≥3分为阳性，<3分为阴性。

1.5血清中IL-8检测实验前1 h取血清于室温下冰盒内缓慢融化，IL-8检测采用武汉优尔生商贸有限公司双抗体夹心ELISA法检测试剂盒，应用全自动ELISA读数仪在450 nm处测定吸光度(OD值)并计算各样本内IL-8的质量浓度。操作步骤同说明书。

2 结果

2.1结肠黏膜组织中RANKL及OPG的阳性表达率RANKL表达阳性率在UC组中为67.9%(19/28)、CD组中为70.0%(7/10)，癌旁组为25.0%(6/24)，IBD患者高于癌旁组，差异有统计学意义(χ2=11.118，P=0.004)，UC组与CD组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；OPG表达阳性率在UC组为75.0%(21/28)，CD组为80.0%(8/10)，癌旁组为33.3%(8/24)，IBD患者高于癌旁组，差异有统计学意义(χ2=11.370，P=0.003)，UC组与CD组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见图1～2)。

2.2血清中IL-8的表达IL-8在UC组(1 724.0±236.0) pg/ml和CD组(1 840.0±220.0) pg/ml患者中的水平高于癌旁组(551.0±167.0)pg/ml，差异有统计学意义(P<0.05)；UC组与CD组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3IL-8与CRP、ESR相关性分析UC患者CRP与IL-8呈显著正相关(r=0.574,P<0.05)；UC患者ESR与IL-8呈显著正相关(r=0.588,P<0.05)；CD患者CRP与IL-8无显著相关性(r=0.491,P>0.05)；CD患者ESR与IL-8呈显著正相关(r=0.673,P<0.05)(见图3)。

3 讨论

IBD是一组发病机制尚不明确的免疫失调性疾病，反复发作的肠黏膜炎性反应是其主要特征。近年来，TNF超家族在IBD中的作用倍受关注，其中RANKL/OPG系统不仅与IBD患者的骨量变化有关，还可通过经典NF-κB途径促进IBD患者肠黏膜炎症的发展[20]。

研究报道[8]，IBD组和健康对照组血浆中未与OPG结合的可溶性RANKL(sRANKL)的水平差异无统计学意义，UC组与CD组患者差异无统计学意义；而UC组和CD组血浆OPG水平较健康对照组升高明显；为了解OPG/RANKL系统的激活状态，得出的OPG/RANKL比率，与健康对照组相比，UC组和CD组显著升高。ASHCROFT等[21]证明，在IL-2缺陷小鼠结肠炎模型中，sRANKL血清水平的升高仅在结肠炎发作的早期阶段，并在9周前迅速下降至正常水平；而OPG水平则持续增加，直至观察期结束仍未达到高峰，这或许可以解释人体中sRANKL处于正常水平，而OPG处于

增加状态。为了明确循环系统中OPG和sRANKL的来源，MOSCHEN等[8]通过结肠外植体培养发现，结肠黏膜巨噬细胞和树突状细胞释放OPG，可知结肠黏膜可能参与了循环系统中OPG的产生，而sRANKL的变化差异无统计学意义。本研究通过免疫组织化学染色检测到IBD患者组RANKL及OPG的表达较对照组升高，其中RANKL多表达于UC患者和CD患者的黏膜固有层，而OPG在对照组黏膜上皮层及黏膜固有层中有少量染色较弱的阳性细胞，CD组黏膜上皮层及固有层中的表达明显升高，UC组表达较CD组差异无统计学意义，结果提示，IBD患者结肠黏膜组织中OPG和RANKL的表达较对照组表达升高，差异有统计学意义。

研究报道[15]，IBD患者中UC和CD分泌的IL-8水平均显著升高，其中活动性UC患者的升高更为突出。与对照组相比，器官培养上清液中IL-8在IBD患者中诱导更高的趋化活性和嗜中性粒细胞的结合能力，特别是在具有活动性UC患者中。当上清液与中和抗IL-8抗体预孵育时，这种诱导炎症发生的作用被显著抑制。本研究通过双抗体夹心ELISA法检测发现，IL-8在UC组和CD组患者血清中的水平较癌旁组呈升高趋势，差异有统计学意义，而UC组与CD组患者差异无统计学意义。提示促炎因子IL-8在IBD患者中处于升高状态。

本文分析IL-8与IBD炎症标志物CRP、ESR相关性，提示IL-8与UC患者CRP、ESR及CD患者ESR呈显著正相关，与CD患者CRP无相关性。由于本文样本量有限，以上结果可经扩大样本量进一步验证IL-8与IBD患者炎症标志物CRP、ESR的相关程度。

总之，本研究发现，RANKL及OPG多在IBD患者的结肠黏膜固有层中表达，且促炎因子IL-8在IBD患者血清中处于升高状态。RANKL/OPG系统及其相关促炎因子IL-8可能参与IBD患者的炎症进程，且IL-8有望成为UC患者的炎症标志物，为研究IBD的发病机制及疾病的早诊断、早治疗提供新的思路。