肠易激综合征模型大鼠结肠肌间神经丛钙视网膜蛋白阳性神经元增加

李 珊， 杨希林， 费贵军， 刘晓红， 方秀才

1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院消化内科，北京 100730； 2.首都医科大学附属北京安贞医院消化内科

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是临床常见的功能性肠病，以腹痛或腹部不适伴排便异常为特征，罗马Ⅳ将其分为腹泻型IBS(IBS with predominant diarrhea，IBS-D)、便秘型IBS(IBS with predominant constipation，IBS-C)、混合型IBS(IBS with mixed bowel habits，IBS-M)等亚型。IBS的病因尚不清楚，肠神经系统(enteric nervous system，ENS)作为“胃肠道的大脑”(brain-in-the-gut)直接调控胃肠道的运动、分泌及与之相适应的血管舒缩活动等，其异常改变参与IBS的发病[1-3]。钙视网膜蛋白(Calretinin，CALR)是一种钙结合蛋白，在ENS肌间神经丛(myenteric plexus，MP)和黏膜下神经丛(submucosal plexus，SMP)主要位于感觉神经元内，与IBS的关系尚不明确[4]。本研究采用IBS-D和IBS-C模型大鼠远段回肠和远端结肠的肠神经丛全层铺片标本(whole mount preparations)观察SMP和MP中表达CALR的神经元的变化，探讨其在IBS发病中的可能作用。

本实验中所应用的慢急性联合应激大鼠模型和冰水灌胃模型可分别模拟IBS-D和IBS-C患者肠道运动、内脏敏感性和心理行为等方面异常[5-6]。我们在此前的研究表明，IBS-D大鼠有腹泻、内脏高敏感，IBS-C大鼠有便秘、内脏高敏感的表现[1，3，7]。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 实验动物：雄性Wister大鼠，体质量160～180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，于北京协和医院SPF级动物房单笼饲养，室温20～24 ℃，12 h/12 h昼夜交替，自由进食进水。

1.1.2 主要试剂：实验中所使用的抗体及稀释比例如表1所示。

表1 研究中使用的抗体Tab 1 Antibodies used in the study

注：Anti-Hu：抗神经核抗体；FITC：异硫氰酸荧光素；Cy3：吲哚菁染料；TRITC：四甲基异氰酸罗丹明。

1.2方法

1.2.1 实验动物分组：大鼠按照体质量进行匹配，分成IBS-D组及其对照组、IBS-C组及其对照组，每组7只。

1.2.2 动物模型建立：(1)IBS-D组及其对照组：参照吕红等[5]方法建立慢急性联合应激IBS-D大鼠模型，慢性应激期每天给予以下应激中的1种：① 禁水24 h；② 禁食24 h；③ 夹尾1 min；④ 45 ℃加热5 min；⑤ 4 ℃冰水游泳3 min；⑥ 12 h/12 h昼夜颠倒；⑦ 水平震荡(160次/min)45 min。上述应激7 d为1个周期，顺序随机，连续2 d内所给予应激种类不同，共持续21 d。慢性应激结束后第7天(即实验第28天)给予急性束缚应激1 h：将大鼠乙醚麻醉至昏迷，束缚双侧肩部、双前肢及胸部限制其上肢搔抓头面部，不限制其活动；对照组大鼠同期饲养，自由进食进水，不进行刺激。(2)IBS-C组及其对照组：采用冰水灌胃方法建立IBS-C模型[6]，即每日予0～4 ℃生理盐水2 ml灌胃，共14 d。对照组大鼠同期饲养，自由进食进水，不进行灌胃。造模过程中无大鼠死亡。

1.2.3 解剖制备回肠和结肠的肠神经丛铺片标本：IBS-D及其对照组大鼠于第28天、IBS-C及其对照组大鼠于第15天进行以下实验。30～50 mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉后剪断双侧颈部血管放血，处死大鼠，剖腹，取距回盲部20 cm处远端回肠6 cm、距肛门3～9 cm 段远端结肠6 cm，沿肠系膜侧剪开肠管，于4 ℃含氧Kreb’s溶液冲洗干净，展开置于质量浓度为20 g/L的甲醛固定液固定24 h。将固定后的标本冲洗后显微镜下剥去黏膜层，然后将标本翻转依次解剖分离去除纵行肌和环形肌肌束，得到完整的SMP铺片标本。将标本浆膜面向上固定，在显微镜下将肠壁的纵行肌和环形肌一同从黏膜下层剥离下来，然后将分离开的肌肉层环行肌面向上，将环形肌的肌束剥离，即可得到MP铺片标本。制作好的铺片标本浸于固定液中，室温保存备用。

1.2.4 Anti-Hu抗体免疫组织荧光检测方法：将制备好的SMP和MP铺片标本室温下PBS漂洗10 min×3次。二甲亚砜(DMSO)浸泡10 min×3次后PBS漂洗。质量浓度为1 g/L硼氰化钠(NaBH4)溶液浸泡10 min×3次后PBS漂洗。质量浓度为100 g/L NDS(封闭血清)室温孵育2 h。加Anti-Hu一抗室温过夜。PBS再次漂洗后加入驴抗小鼠IgG二抗1 h，室温避光。PBS漂洗后将标本完全展开平铺于载玻片上，甘油封片后应用荧光显微镜(Nikon eclipse 80i)观察。

1.2.5 Anti-Hu抗体和CARL抗体免疫组织荧光双染法：按以上所述操作后，荧光显微镜观察到标本中神经元Anti-Hu抗体免疫反应呈阳性后，即进行CALR抗体染色。其步骤如下：PBS漂洗后加CALR抗体，4 ℃避光过夜。PBS漂洗后加山羊抗兔二抗1 h，室温避光。PBS漂洗，铺片、封片后观察并计数。

1.2.6 SMP神经元计数：每只大鼠取2张SMP铺片标本，每张标本随机选取5个不重合低倍视野(10×20倍)，单盲法分别计数视野内神经节数目、神经元总数(anti-Hu免疫反应阳性)以及双染中CALR抗体免疫反应阳性神经元数目。每只大鼠取2张MP铺片标本，每张标本随机选取7～8个(共15个)不重合低倍视野(10×20倍)，单盲法分别计数视野内神经元总数(Anti-Hu免疫反应阳性)以及双染中CALR抗体染色阳性神经元数目。

1.3统计学处理采用SPSS 11.0统计软件进行数据处理。两组间数据比较采用两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠肠道CALR阳性神经元荧光染色特点采用免疫组织荧光双染法分别检测IBS-D及其对照组，IBS-C及其对照组大鼠远端回肠、远端结肠SMP和MP中CALR阳性神经元，发现CALR阳性染色在SMP和MP神经元的胞浆、胞核、神经纤维均有表达，阳性神经元均为卵圆形，不同神经元胞体免疫反应(immunoreactive，IR)强度有一定差异(见图1)。

注：标尺=50 μm。

2.2IBS-D模型大鼠肠神经丛CALR阳性神经元的改变与对照组相比，IBS-D大鼠回肠SMP、结肠SMP和回肠MP中CARL阳性的神经元数目及比例差异无统计学意义(P>0.05)，结肠MP神经元中CALR阳性神经元数目差异无统计学意义(P>0.05)，但结肠MP神经元中CALR阳性神经元所占比例较对照组高[(17.2±3.2)%vs(13.4±2.9)%]，差异有统计学意义(P=0.040)(见表2)。

表2 IBS-D模型大鼠回肠、结肠SMP、MP中CALR阳性神经元数目及比例Tab 2 Calretinin-immunoreactive neurons of ileal and colonic SMP and MP in IBS-D model rats

2.3IBS-C模型大鼠肠神经丛CALR阳性神经元的改变与对照组相比，IBS-C大鼠回肠SMP、结肠SMP和回肠MP中CARL阳性的神经元数目及比例差异无统计学意义(P>0.05)，结肠MP神经元中CALR阳性神经元数目差异无统计学意义(P>0.05)，但结肠MP神经元中CALR阳性神经元所占比例较对照组高[(19.1±5.9)%vs(14.9±3.4)%]，差异有统计学意义(P=0.018)(见表3)。IBS-D模型大鼠、IBS-C模型大鼠结肠MP中CALR阳性神经元所占比例均较对照组高(见图2)。

表3 IBS-C模型大鼠回肠、结肠SMP和MP中CALR阳性神经元数目及比例Tab 3 Calretinin-immunoreactive neurons of ileal and colonic SMP and MP in IBS-C model rats

注：与对照组相比，*P<0.05。

3 讨论

IBS的发病机制复杂，动物模型是对其进行研究的重要手段，稳定性高、可重复性好，评价指标客观的动物模型对认识疾病的机制、病理生理特点、药物治疗等有重要意义[8]。本研究采用的慢急性联合应激大鼠模型能模拟IBS-D患者肠道运动、感觉和心理行为等方面异常[1，3，5]，冰水灌胃大鼠模型能模拟IBS-C患者相关异常[6-7]。

CALR是钙结合蛋白(calcium-binding protein)家族成员，最早从鸡的视网膜基因谱中克隆而得名。该蛋白相对分子量为30～31 kD，是由16q22～q23基因编码含有269～273个氨基酸，其组成在许多物种间高度保守[9]。CALR包含6个“EF-hand”样结构域，其中5个为功能性的Ca2+结合位点；在中枢和外周神经系统均有广泛表达，同时也在肾上腺、胰岛、睾丸等组织有表达，参与机体生殖和内分泌功能调节[9]。CALR主要功能是作为快速或慢速Ca2+缓冲剂，维持细胞中Ca2+稳态，对兴奋性神经毒性起保护作用[9]；还可作为感受器(sensor)监测细胞中Ca2+浓度，并与钙通道蛋白CaV2.1结合以双向调节突触连接的可塑性，从而影响神经元的兴奋性[8]。

CALR在肠神经系统的SMP和MP中均有广泛表达。虽然存在一定的种属差异，但与研究最广泛的豚鼠相比，大鼠ENS中CALR的分布与人类更为接近[10]。既往研究发现，大鼠回肠MP中40%～50%的神经元为CALR阳性，且95%以上同时为胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase，ChAT)阳性，其中表达NK1受体+/NK3受体+/CALR+/Calbindin+的神经元为Dogiel Ⅱ型内在感觉神经元。近年研究发现，除了上述感觉神经元之外，CALR阳性神经元中约18%同时表达Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(CMKⅡ)，这些神经元为Dogiel Ⅰ型中间神经元[11]。在大鼠SMP，CALR+/SP+神经元也主要为感觉神经元，参与肠道的分泌运动反射[12]。在人的SMP大多数神经元同时表达CALR+/VIP+/ChAT±，形态上具有多树突的结构并主要支配黏膜层，在结肠约占SMP神经元总数75%，小肠比例略低于结肠[13]。在人的MP中，约10%神经元同时表达CALR和生长抑素，这可以作为Dogiel Ⅱ型内在感觉神经元的标记[14]；也有部分Dogiel Ⅰ型中间神经元也为CALR阳性。目前，尚无针对IBS患者神经丛中CALR神经元方面的研究。

本研究发现，在IBS-D和IBS-C模型大鼠中，CALR阳性神经元的比例在回肠SMP、MP和结肠SMP中与对照组相比，差异均无统计学意义，而结肠MP中明显升高。提示结肠MP中CALR阳性神经元的增多可能参与IBS-D和IBS-C共同发病机制(即内脏高敏感)，但与IBS亚型无关。在大鼠MP中，CALR阳性的感觉神经元可发出轴突至黏膜层，对腔内化学物质改变等刺激产生反应，其增加可能参与IBS肠道敏感性增高，而与结肠动力无关；部分同时表达CMKⅡ的神经元在调节肠道运动中有重要作用[11]，从而影响IBS的动力功能。

一直以来，IBS被认为是功能性疾病而缺乏解剖学和生化异常，但近年研究发现，与健康人群相比，IBS患者存在一定程度的形态学改变，如炎症细胞浸润、肠道通透性增高及神经内分泌改变[15]。我们既往研究也发现，在IBS-D模型大鼠肠道中SMP的血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)阳性神经元比例增高，MP中一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)阳性神经比例降低，它们可能分别通过影响肠道的分泌和动力参与其腹泻症状的产生[1，3]。由于难以获得IBS患者全层活检(full-thickness)标本，目前仍不清楚IBS患者ENS是否存在类似异常。但部分IBS患者血清中检测出多种抗肠神经元的自身抗体[2，16]，且抗肠神经元阳性的IBS患者血清在体外可引起豚鼠肌间神经元和传代培养的人神经母细胞瘤细胞SH-Sy5Y的凋亡，推测自身免疫反应可能参与ENS改变引起的肠道功能异常[17]。近年国外有报道一种新的内镜下全层活检技术(FTRD System，德国)使肠道全层活检取材成为可能，用于研究IBS患者ENS神经病变，以指导并选择针对性治疗方案，但与腹腔镜下活检的传统方法相比，其安全性和有效性仍需进一步评估[18-19]。

本研究存在一定缺点，由于检测肠道传输功能使用的是活性炭标记技术[1，5]，未能在同一只大鼠同时检测肠道动力和内脏敏感性变化，无法将ENS改变与动力异常进行相关性分析。

综上所述，本研究发现，IBS-D和IBS-C大鼠均有结肠MP中CALR阳性神经元比例增高，推测其可能在IBS的内脏高敏感机制中起一定作用，需要将来进一步深入研究加以证实。