安溪肉桂清咽保健功效评价研究

谭蓉 ， 张颖聪 ， 王静 ， 张志腾 ， 杨秀芳 *

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；2.浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室，浙江杭州 310016；3.安溪县颖昌茶厂，福建安溪 362400）

安溪肉桂产自安溪县大坪乡坪洲村。民间对肉桂茶清咽利喉的效果反馈良好，为了验证这一特殊功效，文章拟通过体内外试验进行功效评价研究。以细菌感染引起的急慢性咽炎为评价指标，进行安溪肉桂的体外抑菌试验研究，同时以《保健食品检验与评价技术规范》（2003）的要求进行大鼠棉球植入试验和大鼠足趾肿胀试验，进一步对安溪肉桂清咽保健功效进行评价。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 体外抑菌试验

试验菌种：普通变形杆菌 CMCC（B）49027，肺炎链球菌ATCC49619，乙型溶血性链球菌ATCC21059，上海鲁微科技有限公司。

试验样品：颖昌牌安溪肉桂干茶样（茶多酚总量14.8%，儿茶素总量7.8%），安溪县颖昌茶厂提供。

试验试剂：甲醇、无水乙醇、氯化钠、浓硫酸、氯化钡，均为分析纯；营养琼脂，血琼脂平板。

1.1.2 体内功效评价

试验动物：SD大鼠，清洁级，80只，体重160～180 g。购自浙江省医学科学院实验动物中心（动物质量合格证号：0008677，许可证号：SCXK（浙）2008-0033）。于室温 23±2 ℃，相对湿度 50%～70%饲养，自由饮食饮水。

试验样品：颖昌牌安溪肉桂提取浓缩液，1 g/mL，分别用蒸馏水稀释5倍、10倍和20倍，配制成浓度为0.2 g/mL、0.1 g/mL和0.05 g/mL的药液备用。

阳性对照：清热散结胶囊（江西普正制药有限公司，批号 150508）；规格：0.35 g×12 粒×4 板，根据人用剂量和动物剂量换算，将胶囊内含物用蒸馏水配制成浓度为63 mg/mL溶液备用。

致炎剂：用生理盐水稀释鸡蛋清配成浓度为10%的蛋清溶液。

试验试剂：TNF-α ELISA试剂盒，批号20151102B，上海源叶生物科技有限公司；IL-6 ELISA试剂盒，批号20151102B，上海源叶生物科技有限公司；IL-1β ELISA试剂盒， 批号20151102B，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

AL-204型电子天平；DK-S24型电热恒温水浴锅；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱；SYQDSX-280A型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅；SPX-150B-Z型生化培养箱；YLS-7A型足趾容量测量仪，山东省医学科学院设备站；Powerwave 340酶标仪，美国Bio-TEK公司；DGG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；CP114电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；Hirayama HVP-50高压灭菌锅，日本Hirayama；Heraeus Biofuge Stra冷冻离心机，德国Heraeus；DS-671电子计重秤，上海寺冈电子有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 纸片抑菌法

参考WS/T 125—1999《纸片法抗菌药物敏感试验标准》进行试验，其中部分步骤稍微修改，具体如下：

使用划线法活化菌株，选择平板上形态相同的菌落至少4～5个，用接种环挑起，移至5 mL的生理盐水中，将菌液浓度调节至0.5麦氏单位比浊管。使用无菌棉签，蘸取菌液，并在上端管壁旋转挤压几次，去掉过多菌液，用棉签涂布平板表面，保证涂布均匀。空白药敏纸片（直径6 mm）在提取液中浸泡1 h后，37℃下烘干，用于下一步的抑菌试验。接种平板后，贴上已经制备好的药敏纸片，用镊子压一下纸片使其与培养基表面贴牢，每块培养基贴6片。随后将平板倒置放在35.5℃的生化培养箱中。经16～18 h培养后观察结果，测量抑菌圈大小，平行3次。

1.3.2 动物试验方法

（1）分组与给药

选取健康雄性SD大鼠40只，按体重随机分为5组，每组8只，即阴性对照组、阳性对照组（清热散结胶囊0.63 g/kg）、安溪肉桂提取物（0.5 g/kg）组、安溪肉桂提取物（1 g/kg）组、安溪肉桂提取物（2 g/kg）组。所有大鼠均给予基础饲料，自由采食饮水。除阴性对照组灌服纯净水外，其余各给药组分别灌服相应药物，每日1次，按1 mL/100 g体重的标准，足趾肿胀模型连续给药29 d，棉球肉芽肿模型连续给药40 d。

（2）指标测定

足趾肿胀度测定：实验结束灌服1 h后，将大鼠固定，于足外踝处画1道横线作标记。用容积测量法测足趾容积，将大鼠后肢拉直放入测量仪玻璃筒内，观察筒内液体水平线与鼠足横线标记处重叠时，测量仪数字显示屏将显示足趾容积数值（mL）。给药前先测一次足趾容积；给药后0.5 h，自足趾中部皮下注入致炎剂（10%蛋清）0.1 mL/只；分别于致炎 1 h、2 h、4 h、6 h后测量大鼠足趾肿胀程度。足趾肿胀度（mL）=给药后足趾体积-给药前足趾体积。

棉球肉芽肿重量测定：将脱脂棉制成约20 mg左右紧致的小棉球，经高压灭菌后，置恒温干燥箱60°C干燥3 h，取出在无菌条件下称重，干燥保存，备用。肉芽肿的形成和测定实验结束前8 d，用脱毛器脱去大鼠两侧腹股沟处的毛，水合氯醛麻醉大鼠，碘伏消毒，在无菌条件下切开大鼠两侧腹股沟皮肤，植入备用的棉球，缝合切口，继续给予样品。末次给药后禁食12 h，水合氯醛麻醉大鼠，在原缝合处剪开皮肤，剥离并取出棉球肉芽组织，恒温干燥箱60°C干燥3 h后称重，计算肉芽肿净量。

肉芽肿净量 （mg）=干燥后棉球肉芽肿重量-原棉球重量。

（3）炎症因子测定

末次给药后禁食12 h，水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，离心制备血清，酶联免疫法测定血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量。

1.4 数据处理

使用Excel 2007对数据进行描述性分析，使用SPSS 19.0对数据进行单因素方差分析。计量资料数据以±SD表示，组间比较采用 t-test，p＜0.05表示差异有显著性。

表1 不同提取溶剂对抑菌圈大小的影响（单位：mm，±SD）Table 1 Influence of different extraction solvents on disc diffusion zone diameters （Unit：mm，±SD ）

表1 不同提取溶剂对抑菌圈大小的影响（单位：mm，±SD）Table 1 Influence of different extraction solvents on disc diffusion zone diameters （Unit：mm，±SD ）

注：不同字母表示存在显著性差异，p＜0.05；-表示不抑菌，下同。Note： different letters indicated significant differences， p＜0.05.“-” indicated no bacteriostasis， the same as followed.

提取溶剂E x t r a c t i o n s o l v e n t乙型溶血性链球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s水--7.7 5±0.3 5 c普通变形杆菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎链球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e 7 0%乙醇 - 9.6 7±0.2 9 b 9.8 0±0.2 7 b 7 0%甲醇 - 1 0.4 0±0.5 5 a 1 0.8 3±0.7 6 a

2 结果与分析

2.1 体外抑菌试验

2.1.1 提取溶剂对抑菌圈大小的影响

分别选择水、70%甲醇及70%乙醇作为提取溶剂，料液比为1∶4（w/v）（此处由于水作为溶剂时，提取料液比最高只能达到1∶4，再提高时基本没有提取液），提取时间为20 min，提取温度为70℃。三种提取溶剂所获得的提取液抑菌效果如表1所示。由上表可知，70%甲醇提取液的抑菌效果较佳。随后，又进行了不同浓度的甲醇提取液对抑菌效果的研究，料液比为 3∶10（w/v），其余提取条件一致，结果如表2所示。从结果可以看出，随着甲醇浓度的增加，对三种菌的抑菌圈大小均呈先增大后减小的趋势，且在70%的甲醇条件下，抑菌效果最佳。因此，后续试验选择70%甲醇作为提取溶剂。

表2 不同浓度的甲醇对抑菌圈大小的影响（单位：mm，±SD）Table 2 Influenceofdifferentconcentrationsofmethanolondiscdiffusionzonediameters （Unit： mm，±SD）

表2 不同浓度的甲醇对抑菌圈大小的影响（单位：mm，±SD）Table 2 Influenceofdifferentconcentrationsofmethanolondiscdiffusionzonediameters （Unit： mm，±SD）

甲醇浓度M e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n乙型溶血性链球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s 6 0%甲醇 7.0 0±0.0 0 a 9.2 5±0.3 5 b 9.7 5±0.3 5 b 7 0%甲醇 7.2 5±0.3 5 a 1 0.5 0±0.7 1 a 1 1.7 5±0.3 5 a 8 0%甲醇9 0%甲醇普通变形杆菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎链球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e- -9.0 0±0.0 0 b-9.2 5±0.3 5 b 8.0 0±0.0 0 c

2.1.2 提取温度对抑菌圈大小的影响

分别选择60℃、70℃、80℃和90℃为提取温度，料液比为 3∶10（w/v），提取时间为 20 min，考察相应提取液抑菌圈的大小，结果如表3所示.从结果可以看出，70℃和90℃提取时提取液抑菌圈最大，且与另外两个提取温度下提取液的抑菌圈大小均存在显著性的差异（p＜0.05）。综合考虑，后续使用70℃作为提取温度。

表3 不同提取温度对抑菌圈大小的影响（单位：mm，±SD）Table 3 Influence of different extraction temperatures on disc diffusion zone diameters （ Unit： mm，±SD ）

表3 不同提取温度对抑菌圈大小的影响（单位：mm，±SD）Table 3 Influence of different extraction temperatures on disc diffusion zone diameters （ Unit： mm，±SD ）

温度T e m p e r a t u r e乙型溶血性链球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s 6 0 ℃ - 7.7 5±0.3 5 b 8.5 0±0.0 0 b 7 0 ℃ 7.2 5±0.3 5 b 1 0.5 0±0.7 1 a 1 1.1 7±0.2 9 a 8 0℃9 0℃普通变形杆菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎链球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e-9.2 5±0.3 5 a 7.7 5±0.3 5 b 9.2 5±0.3 5 a 8.7 5±0.3 5 b 1 1.5 0±0.7 1 a

2.1.3 提取时间对抑菌圈大小的影响

分别选择 5 min、10 min、20 min 和 30 min 为提取时间，料液比为 3∶10（w/v），考察相应提取液抑菌圈的大小，结果如表4所示，从表中可以看出，提取时间在20 min时，对三种菌的抑菌圈效果较好，且与30 min的结果没有显著性的差异。因此，后续试验选择20 min作为提取时间。

表4 不同提取时间对抑菌圈大小的影响（单位：mm，±SD）Table 4 Influence of different extraction time on disc diffusion zone diameters （ Unit： mm，±SD ）

表4 不同提取时间对抑菌圈大小的影响（单位：mm，±SD）Table 4 Influence of different extraction time on disc diffusion zone diameters （ Unit： mm，±SD ）

乙型溶血性链球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s 5 m i n - 8.7 5±0.3 5 b 9.7 5±0.3 5 b 1 0 m i n - 9.5 0±0.5 0 b 9.8 3±0.2 9 b 2 0 m i n 3 0 m i n时间T i m e普通变形杆菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎链球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e 7.2 5±0.3 5 a 7.3 3±0.2 9 a 1 0.5 0±0.7 1 a b 1 0.7 5±0.3 5 a 1 1.1 7±0.2 9 a 1 1.2 5±0.3 5 a

2.1.4 不同料液比对抑菌圈大小的影响

根据上述获得的较优提取条件，考察不同料液比对三种菌的抑菌效果，结果如表5所示，从结果中可以看出，抑菌圈的大小都随着料液比的增加而增大。当料液比达到3.5∶10后，三种菌的抑菌圈均不再显著增加（p＜0.05）。但是三种菌的最佳料液比有一定的差异，以最先出现显著性差异的结果为最佳比例，普通变形杆菌为3.5∶10，肺炎链球菌为 2.5∶10，乙型溶血性链球菌为 3∶10。

表5 不同料液比对抑菌圈大小的影响（单位：mm，±SD）Table 5 Influence of different solid-liquid ratio on disc diffusion zone diameters(Unit:mm,±SD)

表5 不同料液比对抑菌圈大小的影响（单位：mm，±SD）Table 5 Influence of different solid-liquid ratio on disc diffusion zone diameters(Unit:mm,±SD)

料液比S o l i d-L i q u i d r a t i o乙型溶血性链球菌β-H e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s 1∶1 0 - - -1.5∶1 0 2∶1 0普通变形杆菌P r o t e u s v u l g a r i s肺炎链球菌S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e---9.2 5±0.3 5 b 8.2 5±0.3 5 c 1 0.2 5±0.3 5 b 2.5∶1 0 3∶1 0 3.5∶1 0 4∶1 0-7.2 5±0.3 5 b 7.6 7±0.2 9 a 8.6 7±0.2 9 a 1 0.4 0±0.5 5 a 1 0.5 0±0.7 0 a 1 0.1 0±0.2 2 a 1 0.5 0±0.5 0 a 1 0.8 3±0.7 a b 1 1.1 7±0.2 9 a 1 1.4 0±0.2 2 a 1 1.5 0±0.5 0 a

综上，安溪肉桂对三种菌均有一定的抑制效果，其中对乙型溶血型链球菌的抑制效果最佳，其次是肺炎链球菌，对普通变形杆菌的抑制效果较弱。

2.2 动物体内功效评价试验

2.2.1 大鼠足趾肿胀试验结果

与阴性对照组比较，阳性组及安溪肉桂提取物组在致炎后1 h开始对大鼠足趾肿胀有显著的抑制作用（p＜0.05）。安溪肉桂提取物高剂量组（2 g/kg）于致炎后1 h开始即可显著减轻大鼠足趾肿胀度，抗炎作用一直持续至致炎后6 h（p＜0.05）。安溪肉桂提取物低剂量组（0.5 g/kg）及中剂量组（1 g/kg）在致炎后2 h内有明显减轻足趾肿胀度的作用。由上述结果可以看出安溪肉桂提取物对蛋清所致的大鼠足趾肿胀有明显的抑制作用。

2.2.2 大鼠棉球肉芽肿试验结果

与阴性对照组比较，阳性组及安溪肉桂提取物组的肉芽肿重量有显著性的下降（p＜0.05）。安溪肉桂提取物3个剂量均可极显著地减轻大鼠肉芽肿重量（p＜0.01）。由上述结果可以看出安溪肉桂提取物对棉球所致的大鼠肉芽肿有明显抑制作用。

表6 大鼠足趾肿胀试验结果（±SD）Table 6 Results of paw edema experiment in rats(±SD)

表6 大鼠足趾肿胀试验结果（±SD）Table 6 Results of paw edema experiment in rats(±SD)

注：与阴性对照组比较，* 表示差异显著（p＜0.05），** 表示极显著差异（p＜0.01），下同。Note:Compared with the negative control group，*indicated significance at p＜0.05，**indicated significance at p＜0.01，the same as followed.

致炎后6 h 6 h o u r a f t e r i n f l a m m a t i o n s阴性对照组 8（1 6） - 0.6 6±0.1 9 0.6 1±0.1 7 0.4 9±0.2 0 0.4 0±0.1 7阳性对照组 8（1 6） 0.6 3 0.4 6±0.2 4** 0.4 6±0.1 6** 0.4 5±0.1 4 0.3 2±0.1 7组别T r e a t m e n t s动物数（足趾数）N u m b e r o f a n i m a l(n u m b e r o f t o e s)剂量（g/k g）D o s a g e致炎后不同时间足趾肿胀度（m L）R a t e o f r a t p a w e d e m a致炎后1 h 1 h o u r a f t e r i n f l a m m a t i o n致炎后2 h 2 h o u r a f t e r i n f l a m m a t i o n致炎后4 h 4 h o u r a f t e r i n f l a m m a t i o n安溪肉桂提取物8（1 6） 0.5 0.5 2±0.1 7* 0.4 8±0.1 4* 0.4 6±0.1 6 0.3 4±0.1 6 8（1 6） 1 0.5 0±0.2 2* 0.4 0±0.1 5** 0.3 8±0.1 9 0.2 6±0.1 6*8（1 6） 2 0.4 7±0.1 6** 0.4 6±0.1 6* 0.3 8±0.1 6* 0.2 7±0.1 0*

表7 大鼠棉球植入试验结果（±SD）Table 7 Results of cotton ball implantation experiment in rats(±SD)

表7 大鼠棉球植入试验结果（±SD）Table 7 Results of cotton ball implantation experiment in rats(±SD)

肉芽肿重量（m g）N e t w e i g h t o f r a t g r a n u l o m a阴性对照组 8（1 6） - 1 3 8.1 8±6 3.2 4阳性对照组 8（1 6） 0.6 3 9 6.1 5±4 9.5 9*组别T r e a t m e n t动物数（肉芽肿数）N u m b e r o f a n i m a l剂量（g/k g）D o s a g e安溪肉桂提取物8（1 6） 0.5 9 0.3 2±3 1.7 1**8（1 6） 1 8 5.8 4±3 3.4 5**8（1 6） 2 7 0.0 5±3 3.1 7**

2.2.3 对血清炎症因子的影响

与阴性对照组比较，阳性组及安溪肉桂提取物高剂量组（2 g/kg）的三种炎症因子均有显著性的下降（p＜0.05）。安溪肉桂提取物低剂量（0.5 g/kg）和中剂量（1 g/kg）未见此效果。由上述结果可以看出安溪肉桂提取物（2 g/kg）可显著性地降低大鼠血清中的 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量（p＜0.05）。

表8 对大鼠血清炎症因子的影响Table 8 Effect on serum inflammatory factors in rats

3 讨论

王润明[1]对0～7岁儿童咽部感染病原菌的调查中发现了肺炎链球菌、普通变形杆菌、大肠埃希氏菌等。同时，在对清热颗粒、清热利咽茶和对急慢性咽炎药物的体外抑菌性研究中，均使用到了乙型溶血型链球菌、肺炎链球菌和普通变形杆菌[2-4]。因此，研究选用了乙型溶血型链球菌、肺炎链球菌和普通变形杆菌这三种菌作为受试菌种。在预试验研究中发现，使用一般冲泡的方法进行提取获得的提取液并没有明显的抑菌效果，因此随后使用了有机试剂进行提取。较多研究发现，黄酮对普通变形杆菌[5-6]、肺炎链球菌[7-8]和乙型溶血性链球菌[9-10]都有良好的抑菌作用，且黄酮对乙型溶血性链球菌的抑菌性要优于肺炎链球菌，尽管所测肉桂中茶多酚含量不高，但其良好的抑菌效果可能与其儿茶素组成及黄酮类物质占比有关，具体结果还需要进一步验证。

体内外试验说明安溪肉桂提取物具有较明显的抗炎作用，具有干预急性炎症（足趾肿胀）和慢性炎症（肉芽肿形成）的作用，并能减少炎症因子的产生。根据保健食品检验与评价技术规范（2003版）可得出，动物试验证明安溪肉桂茶具有一定的清咽保健功效，但还需要后续人体试食实验来进一步验证。