Cd胁迫下水稻叶片SOD活性和MDA含量与糙米中Cd含量的相关性研究

彭鸥，叶长城，刘玉玲，李丹阳，刘寿涛，罗海艳，铁柏清,*

1. 湖南农业大学资源环境学院，长沙 410128 2. 湖南省灌溉水源水质污染净化工程技术研究中心，长沙 410128 3. 农业农村部南方产地污染防控重点实验室，长沙 410128

湖南是著名的鱼米之乡，近年来由于受污水灌溉、城市垃圾乱弃及矿产开发等的影响，湖南地区受Cd污染较为严重，在某些工业园区周围的农田土壤中Cd含量达到4.22 mg·kg-1[1]，农田Cd污染问题也日益严重[2]，对湖南稻米安全生产产生较大威胁。与其他重金属元素相比，Cd的活性较强，容易被水稻吸收和富集，可以在不影响水稻正常生长的情况下积累较高含量的Cd[3-4]，包括食用的稻米部位，从而威胁食品安全[5-6]。

Cd胁迫下，植物体内会形成过量的氧自由基，从而影响抗氧化酶活性，破坏质膜系统和生物大分子，抑制植株生长[7]。水稻在Cd胁迫条件下，通过抑制种子中淀粉酶、蛋白酶等的活性，抑制种子内淀粉和蛋白质的分解，从而影响种子的萌发[8-9]。一般认为，Cd的这种生长抑制作用与其影响植物体内活性氧自由基代谢有关[10-11]。超氧化物歧化酶(SOD)是植物体内清除和减少破坏性氧自由基的保护酶，对于防止氧自由基破坏细胞的组成、结构和功能，保护细胞免受氧化损伤具有十分重要的作用，其活性大小常被用作植株抗氧化能力强弱的指标[12]。丙二醛(MDA)是植物组织在逆境下遭受氧化胁迫发生膜脂过氧化的产物，其含量的积累是自由基毒害作用的表现，因此，MDA可以代表细胞的脂质过氧化水平和生物膜损伤程度的大小，反映细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱[13-14]。

鉴于湖南耕地Cd污染现象严重，本试验考察不同浓度梯度Cd2+胁迫对水稻的影响，通过研究Cd胁迫下水稻农艺性状的变化以及叶片SOD活性和MDA含量变化，旨在分析水稻叶片SOD活性和MDA含量与糙米Cd含量的相关性。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 供试品种

供试品种为中嘉早17号(常规籼稻，全生育期109 d)。水稻幼苗3叶1心后于4月24日移栽，5月3日开始添加外源Cd，到7月21日收获水稻。

1.2 试验方法

采用室外盆栽水培试验，利用营养液对水稻进行全生育期培养，共设置6个不同Cd浓度的处理水平，每个处理水平重复3次，编号为Cd0、Cd10、Cd50、Cd200、Cd500和Cd1000，其营养液中Cd浓度分别保持为0、10.00、50.00、200.00、500.00和1 000.00 μg·L-1。

水稻所需营养液配制方法采用木村B营养液和Arnon(1939)微量元素营养液配制方法[15]。试验中水稻于盛有基础营养液10 L的塑料桶中，加入微量元素贮备液10 mL。水稻采用泡沫育苗盘和定植篮固定，每桶5穴，每穴3株。水稻幼苗移栽7 d后开始添加外源Cd，营养液前期5～7 d更换，后期3～4 d更换[16]，每2天用0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1HCl调pH至5.5。

1.3 分析测定与数据处理

1.3.1 样品处理及测定

(1) 农艺指标的测定。分别于5月24日(分蘖期)、6月15日(孕穗期)、7月10日(乳熟期)用卷尺测定水稻根长及株高。在7月10日(乳熟期)数取水稻有效分蘖数，并取3个重复处理平均值。7月28日水稻风干后称取水稻产量(以稻谷干重计)。

(2) MDA含量和SOD活性测定。在测量水稻根长株高后，同时取第一片完全展开叶片，用于MDA含量和SOD活性的分析。植株样品用磷酸缓冲液(pH 7.8)于冰浴中研磨，匀浆在1 000 r·min-1下离心20 min，取上清液，即为MDA和SOD的粗提液[17]。分别测定MDA含量和SOD活性。

(3)水稻Cd含量测定。水稻样品采集后，先用自来水小心洗净根系，然后用去离子水清洗整个植株，将植株根系、茎鞘、叶和穗手工分离，在103 ℃杀青1 h，置于烘箱65 ℃烘至恒重，称取各部位干重。稻谷风干晒干后用砻谷机分离出糙米和稻壳。所有样品粉碎过100目筛，全部装入自封袋内密封保存备用。称取水稻各部位样品(0.5000±0.0005) g置于消解管中采用混合酸(V(HNO3)∶V(HClO4)=4∶1)湿法消解并定容[18]。采用ICP-OES(美国PE8300)测定Cd含量>0.1 mg·kg-1的水稻样品；用原子吸收分光光度计-石墨炉法(GTA120，美国Varian)测定Cd含量<0.1 mg·kg-1的水稻样品。

1.3.2 数据处理方法

运用IMB SPSS(Statistical Product and Service Solutions, 22.0)对数据进行统计分析处理；运用Microsoft Excel 2010软件制作数据表格。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 Cd胁迫下中嘉早17号农艺性状分析

由表1可知，低浓度(10 μg·L-1)Cd胁迫对中嘉早17号生长有一定的促进作用，但与对照差异不显著；在高浓度(>200 μg·L-1)Cd胁迫下，水稻根长、株高、有效分蘖数和产量均显著降低。Cd胁迫浓度<50 μg·L-1时，对水稻未表现出显著伤害。就水稻生育期来看，Cd胁迫浓度>200 μg·L-1时，水稻生长缓慢，在分蘖期到孕穗期这段时期内，Cd1000处理根长仅平均增长1.73 cm、株高仅平均增长28.86 cm，明显低于低浓度Cd胁迫组和对照组。在乳熟期，Cd胁迫浓度>200 μg·L-1时，株高和根长与对照差异显著。同时，高浓度Cd胁迫影响水稻分蘖，Cd胁迫浓度>200 μg·L-1时有显著影响。就水稻产量而言(以稻谷干重计)，低浓度Cd胁迫能增加产量，但效果不显著，Cd胁迫浓度<50 μg·L-1时，对水稻产量未产生显著影响，在Cd胁迫浓度>50 μg·L-1时，水稻产量有显著降低。在1 000 μg·L-1Cd胁迫下水稻不能正常结实，籽粒基本上空瘪。

2.2 Cd胁迫下中嘉早17号糙米的Cd含量

由图1可知，中嘉早17号全生育期在不同浓度Cd胁迫下，糙米中Cd含量差异明显。水稻全生育期在10 μg·L-1Cd胁迫下，水稻成熟后糙米中Cd含量达到0.75 mg·kg-1，远远超过国家标准。水稻全生育期在50 μg·L-1Cd胁迫下，水稻成熟后糙米中Cd含量达到1.42 mg·kg-1，是10 μg·L-1Cd处理组糙米Cd含量的1.89倍。200、500和1 000 μg·L-1Cd处理组糙米中Cd含量分别达到2.25、4.20和9.36 mg·kg-1。随着Cd胁迫浓度增加，糙米Cd含量越大，且呈正相关关系。

表1 Cd胁迫下中嘉早17号农艺性状Table 1 The major agronomic traits of Zhongjiazao 17 rice under cadmium stress

注：Cd0、Cd10、Cd50、Cd200、Cd500和Cd1000表示不同试验处理浓度分别为0、10.00、50.00、200.00、500.00和1 000.00 μg·L-1；每列小写字母不同表示不同处理间差异显著，P<0.05。
Note: Cd0, Cd10, Cd50, Cd200, Cd500, and Cd1000 represent different test treatment concentrations of 0, 10.00, 50.00, 200.00, 500.00, and 1 000.00 μg·L-1; the different lowercase letters in each column indicate significant differences between different treatments,P< 0.05.

图1 Cd胁迫下中嘉早17号的糙米Cd含量注：小写字母不同表示不同处理间差异显著，P<0.05。Fig. 1 Cd content of Zhongjiazao 17 brown rice under Cd stressNote: The different lowercase letters indicate significant differences between treatments, P<0.05.

2.3 Cd胁迫下中嘉早17号SOD活性和MDA含量差异

由表2可知，整个生育过程中，中嘉早17号叶片SOD活性对Cd胁迫有着相同的响应。在水稻的3个主要生育期，不同Cd胁迫处理，SOD活性规律为Cd1000>Cd500>Cd200>Cd50>Cd10>Cd0。不同生育时期孕穗期SOD活性最低，分蘖期最高，乳熟期次之。在Cd胁迫下水稻SOD活性有如下的变化趋势：Cd胁迫浓度越高，SOD活性越强；SOD活性在不同生育期表现的规律为分蘖期>乳熟期>孕穗期。

在Cd胁迫下，各生育期中，中嘉早17号叶片的MDA含量均以Cd1000处理最高，Cd0处理最低，说明高浓度Cd胁迫增加水稻叶片MDA含量。从生育时期看，水稻叶片的MDA含量在水稻生长发育过程中呈增加趋势，分蘖期的MDA含量最低，成熟期水稻叶片的MDA含量明显高于孕穗期。

2.4 Cd胁迫水平下水稻叶片SOD活性及MDA含量与水稻糙米Cd含量的相关性

由图2可知，水稻在Cd胁迫下糙米Cd含量与各时期SOD活性均显著相关(P<0.01)。水稻糙米中Cd含量与Cd胁迫浓度呈正相关，SOD活性亦如此。从不同时期来看，在Cd胁迫下分蘖期水稻SOD活性达到最大值，与糙米Cd含量相关系数r=0.97，且在P<0.01水平下显著相关。在孕穗期水稻SOD活性较低，但与糙米Cd含量相关性最高，相关系数r=0.97。水稻在乳熟期SOD活性高于孕穗期，与糙米Cd含量相关性显著。水稻叶片SOD活性与糙米Cd含量在3个主要时期相关性均显著。

由图3可知，水稻在Cd胁迫下糙米Cd含量与各时期MDA含量均极显著相关(P<0.01)。在Cd胁迫下分蘖期水稻MDA含量最低，与糙米Cd含量相关性显著(r=0.766)。在水稻孕穗期MDA含量与糙米Cd含量相关系数r=0.869，且在P<0.01水平下极显著相关性。在随着水稻的生长，在乳熟期MDA含量高于前两个生育期，与糙米Cd含量相关性也越高，相关系数r=0.945。水稻叶片MDA含量与糙米Cd含量在3个主要时期相关性显著。

3 讨论(Discussion)

低浓度Cd胁迫对水稻生理状态无明显影响，但水稻富集吸收Cd会形成对人类有害的Cd米。本研究表明，低浓度(10 μg·L-1)Cd胁迫对水稻生长有一定促进作用，当Cd胁迫达到一定限度时，会抑制水稻根的生长，使根弯曲，减少根数等[19]。随着Cd胁迫浓度的提高，抑制作用会逐渐增强，进而使水稻株高降低、生长迟缓、植株鲜重减小、叶片变黄并出现坏死斑和伤流液量减少等一系列生理状况[20]。前人研究认为，一定浓度Cd胁迫能显著降低水稻的产量、结实率和粒重等经济性状以及不同生育期的地上部干物质质量[21]。陈志德等[22]的研究表明，Cd对每穗粒数的影响大，而对穗数、结实率和千粒重影响小，Cd处理后每穗粒数降低是各品种籽粒产量降低的主要原因。

表2 Cd胁迫下中嘉早17号叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量Table 2 The superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content in leaves of Zhongjiazao 17 rice under cadmium stresses

注：每列小写字母不同表示不同处理间差异显著，P<0.05。
Note: The different lowercase letters in each column indicate significant differences between treatments,P<0.05.

图2 Cd胁迫下中嘉早17号叶片SOD活性与糙米Cd含量相关性注：(a). 分蘖期，(b). 孕穗期，(c). 乳熟期。Fig. 2 Correlation between the SOD activity in leaves and the cadmium content in brown rice in Zhongjiazao 17 rice under cadmium stressesNote: (a). Tillering stage, (b). Booting stage, (c). Milking stage.

在受Cd胁迫的环境下，Cd会影响水稻的叶绿素含量以及光合系统，并改变MDA含量和SOD、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性[23]。Cd对植物的毒害可能是通过产生H2O2的方式进行的，因此抗氧化酶系统对植物耐Cd胁迫具有重要作用[24]。Cd胁迫可以提高水稻体内抗氧化酶的活性，但随着Cd浓度的增加酶活性逐渐降低[25]，但在本研究中，Cd胁迫浓度越高，水稻SOD活性越强，但在0～1 000 μg·L-1范围内Cd2+胁迫的水稻叶片酶活性没有降低的趋势。邵国胜等[10]研究认为，分蘖期是不同基因型水稻SOD活性差异最大的时期，在分蘖期中嘉早17号的SOD活性明显高于其他2个时期。这表明，水稻生育早期是对Cd胁迫最敏感的时期，随着生育进程推进，水稻对Cd胁迫的适应性增强，Cd胁迫对SOD活性影响减小。水稻到乳熟期后，因为水稻体内Cd含量积累到一定程度，SOD活性则出现了一定的波动。章秀福等[7]的研究表明，水稻植株吸收和积累Cd的能力与酶活性存在负相关关系，但本研究发现，水稻成熟后糙米中Cd含量与水稻叶片SOD活性呈正相关，且相关性显著，可以看出抗氧化酶系统在对Cd胁迫的防卫机制中具有重要作用，但有一定的浓度限制且存在品种间的差异。本研究表明，随着Cd胁迫浓度的升高，水稻叶片的MDA含量升高，且MDA含量与糙米中Cd含量呈明显正相关，这与王昌全等[26]的研究结果一致。随着Cd胁迫浓度和时间的增加，水稻叶片MDA含量呈逐渐上升的趋势[27]，且乳熟期的MDA含量最高，孕穗期次之，分蘖期最低。同时，高浓度Cd胁迫比低浓度Cd胁迫更易对水稻造成伤害[28]。随着Cd胁迫浓度的提高和生育时期的推进，水稻叶片质膜的组成和完整性遭到破坏，细胞内产生大量自由基，但由于清除自由基的能力下降，引起质膜发生过氧化，MDA含量增加[14]。

图3 Cd胁迫下中嘉早17号叶片MDA含量与糙米Cd含量相关性注：(a). 分蘖期，(b). 孕穗期，(c). 乳熟期。Fig. 3 Correlation between the MDA content in leaves and the cadmium content in brown rice in Zhongjiazao 17 rice under cadmium stressesNote: (a). Tillering stage, (b). Booting stage, (c). Milking stage.

综上所述，在Cd胁迫下水稻叶片SOD活性和MDA含量随Cd胁迫浓度增大而增大，且二者与糙米Cd含量呈显著正线性相关。