铜污染草地对放牧乌蒙半细毛羊矿物质元素代谢的影响

霍宾，吴婷，肖华，申小云,,3,*

1. 西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳 621010 2. 贵州师范大学国家喀斯特石漠化防治工程技术研究中心，贵阳 550025 3. 中国西南世界银行扶贫项目贵州办公室，贵阳 550004

乌蒙半细毛羊产业是乌蒙山区的支柱产业，是该区少数民族赖以生存和发展的物质基础，具有产毛量高、肉用性能好、早熟、耐粗饲和适应性强等特点，在乌蒙山区草地生态畜牧业发展中起到了关键作用[1-2]。乌蒙半细毛羊是利用本地绵羊(藏系山谷型粗毛羊)导入肉毛兼用的考力代、新疆半细毛羊和林肯羊等半细毛羊血液杂交育成的毛肉兼用型羊种，经1974—1982年的级进杂交，1982—1990年的横交固定，1990—2007年的扩群推广已经形成一个生产性能较好、遗传性能相对稳定的绵羊育种群[3]。从2007年开始，笔者团队在现有研究基础上开展乌蒙半细毛羊的进一步培育工作，到2017年已经育成生产性能优秀、遗传性能稳定的绵羊新品种，其各项生产性能都明显高于当地其他品种，在乌蒙山区草地生态畜牧业发展中起到了关键的作用，是当地牧民群众生产生活资料的主要来源。

重金属污染是指由重金属或其化合物对环境造成的污染[4-6]。重金属具有致癌、致畸及致突变作用，严重威胁人体健康和食品安全。重金属难以分解，不但对生物体造成直接伤害，还沿食物链富集，危害整个生态系统[4-5]。随着现代工业的发展，重金属对环境的污染日益严重，给人们的生产、生活和身心健康带来了极大危害[5-8]。乌蒙山区气候温暖湿润，冬无严寒，夏无酷暑，拥有丰富的饲料资源，发展草地畜牧业具有得天独厚的自然条件，也是我国西部矿产资源的聚宝盆。近年来，由于国民经济和社会的快速发展，对各种矿产资源的需求高速增长，开采规模不断增加，矿山加工企业如雨后春笋般蓬勃发展，产生的污染物大量排放，导致生态环境严重破坏，此外，污染还通过食物链富集危害动物和人类的健康[8-9]。重金属铜污染是乌蒙山区主要污染形式之一，污染区域土壤和牧草的铜含量严重超标，部分区域达到正常含量的3～5倍，同时伴有镉、铅和锌等元素的污染[9-10]。对草地畜牧业和人类健康造成了严重的影响，对乌蒙半细毛羊产业的影响尤为明显。为了寻找铜污染草地无害化利用的技术和方法，减少铜污染对乌蒙半细毛羊产业的影响，笔者开展了铜污染草地对放牧乌蒙半细毛羊矿物质元素代谢影响的研究。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验设计

1.1.1 放牧试验

随机选择1岁的乌蒙半细毛羊公羊18只，体重(35±2.5) kg，临床检查健康。试验组：在赫章县妈姑镇选择12 hm2的铜污染草地，试验前经初步分析土壤有机质含量为8.3%～12.8%，pH为6.04±0.23，铜含量为(72.45±18.33) μg·g-1；牧草铜含量(15.35±8.47) μg·g-1，用围栏分为相等的2个部分，每部分放牧6只乌蒙半细毛羊。对照组：在威宁县凉水沟选择6 hm2的无污染草地，试验前经初步分析土壤有机质含量为7.9%～11.5%，pH为6.23±0.35，铜含量为(16.15±1.23) μg·g-1；牧草铜含量为(5.13±0.73) μg·g-1，放牧6只乌蒙半细毛羊。实验组和对照组均为自然放牧，放牧试验时间为2017年4月20日至2017年6月20日，共60 d。

1.1.2 矿物质补充试验

放牧试验结束时，在赫章县妈姑镇铜污染草地放牧的12只乌蒙半细毛羊随机分为2组(处理Ⅰ、处理Ⅱ)，继续在铜污染牧场放牧。处理Ⅰ：补充饲喂硫酸钠(Na2SO4)，每只羊10 g·d-1，连续补充15 d，饲喂方式为分别在早晨和傍晚各称取5 g Na2SO4，按照硫酸钠∶玉米面为1∶20的质量比例调和后投喂；处理Ⅱ：不做任何处理。

1.2 样品的采集

1.2.1 土壤样品的采集

试验开始时，分别在姑妈镇和凉水沟的试验草地采集土壤样本。随机采集0～20 cm的表层土壤样品30个(试验组每个处理10个，共20个；对照组10个)。样品在l m×l m的样方中采集，各样方间隔100 m，每个样方采集1个，每个样本200 g，用于分析重金属元素含量，标记采样点，为同地点采集牧草样品做准备。

1.2.2 牧草样品的采集

试验开始前，分别在姑妈镇和凉水沟的试验草地采集混合牧草样本。随机采集混合植物样品30个(试验组每个处理10个，共20个；对照组10个)，为减少不同牧草品种对矿物质含量的影响，以土壤样品采集点为圆心，选择离圆心100 m，均匀分布的10个点(每个点相互间隔200 m)，每个点采集20 g牧草，10个点牧草混合组成1个200 g的牧草样品，为了减少土壤污染，采集离地0.1 cm以上的牧草部分。

1.2.3 血液样品及肝活体组织采集

试验结束时，用真空采血管采集颈静脉血液10 mL，血液温度降到室温后，8 h内低温4～8 ℃运回实验室做进一步的研究和分析。肝脏活体组织采集，由操作熟练的专门技术人员采用肝脏穿刺术采集，采集后的样本固定于标本瓶内，同血液一起低温送回实验室[11]。

1.3 样品的处理

采用微波消解法，利用微波加热封闭容器中的消解液，在高温增压条件下使各种样品快速溶解。土壤、牧草在室温下晾干至恒重，土壤过200目筛，用硝酸(HNO3)、高氯酸(HClO4)和氢氟酸(HF)(体积比5∶2∶5)混合液微波加热溶解样品，牧草和动物组织用硝酸和高氯酸(体积比4∶1)混合液微波加热溶解样品[12]。

1.4 分析测试

1.4.1 重金属元素的检测

分析土壤、牧草和动物组织的重金属元素含量应用电感耦合等离子体原子发射光谱法(Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy, ICP-AES)[12]。使用仪器为电感耦合等离子体发射光谱仪(HK9600 Type Atomic Emission Spectroscopy, Huaketiancheng Co., Ltd, China)。分析的元素种类为锰(Mn)、锌(Zn)、钴(Co)、铜(Cu)、铁(Fe)、磷(P)、钼(Mo)和硒(Se)。

1.4.2 血液指标的检测

用动物专用全自动血细胞分析仪(Automatic Blood Cell Analyzer, Sysmex Poch-100i Veterinary, Japan)检测血红蛋白(hemoglobin, Hb)、红细胞数(red blood cell count, RBC)、红细胞压积(packed cell volume, PCV)、平均红细胞体积(mean corpuscular volume, MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin, MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC)和白细胞数(white blood cell count, WBC)[2]。用生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱苷肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、铜蓝蛋白(ceruloplasmin, Cp)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、磷酸肌酸激酶(creative phosphokinase, CPK)和天门冬氨酸氨基转移酶(glutamic oxaloacetic transaminase, GOT)。

1.5 数据分析

研究数据整理分析应用SPSS软件(version 22.0 for Windows; Chicago, Illinois, USA)，数据用独立样本t检验来估测各处理间的差异显著性(P<0.05、P<0.01，Student’st-test)。

2 结果(Results)

2.1 铜污染草地放牧试验

2.1.1 铜污染草地土壤和牧草矿物质元素含量

铜污染草地土壤和牧草铜含量显著高于对照组(P<0.01)。土壤和牧草锌的含量显著高于对照组(P<0.05)。其他元素没有明显的差异，如表1所示。

2.1.2 铜污染对动物血液和肝脏矿物质含量的影响

铜污染草地放牧动物(试验组)血液铜和锌的含量显著高于对照组(P<0.01)，钼和铁的含量显著低于对照组(P<0.05)。铜污染草地放牧动物(试验组)肝脏铜和锌的含量显著高于对照组(P<0.01)，钼和铁的含量显著低于对照组(P<0.05)。其他元素没有显著的差异，如表2所示。

2.1.3 铜污染对动物的血液指标的影响

铜污染草地放牧动物(试验组)Hb、PCV、RBC和MCV显著低于对照组(P<0.01)。其他指标无显著差异，如表3所示。试验组SOD、CAT和GSH-Px显著低于对照组(P<0.01)，Cp、MDA、CPK和GOT显著高于对照组(P<0.01)，如表3所示。

2.1.4 铜污染对羊毛产量、品质和羊体重的影响

试验组产毛量、羊毛的长度显著低于对照组(P<0.01)。对净毛率和细度没有显著的影响。铜污染草地放牧，对羊生长速度和羊毛铜含量有显著的影响，试验组体重平均增重量显著低于对照组(P<0.01)，试验组羊毛平均铜含量显著高于对照组(P<0.01)，如表4所示。

2.2 动物矿物质补充试验

硫元素补充对产毛量、净毛率、细度和长度均无显著影响。对生长速度也没有显著的影响，在整个试验期间，处理Ⅰ组平均增重量(3.78±0.13) kg，处理Ⅱ组平均增重量(3.97±0.12) kg，对羊毛铜含量没有显著的影响，处理Ⅰ组羊毛平均铜含量(8.79±0.72) μg·g-1，处理Ⅱ组羊毛平均铜含量(8.58±0.81) μg·g-1。

2.2.1 补充硫对血液矿物质含量的影响

同试验开始时比较，试验结束时处理Ⅰ组铜含量显著降低(P<0.01)，同时显著低于处理Ⅱ组(P<0.01)，处理Ⅰ组钼含量同试验开始时比较明显降低(P<0.01)，但同处理Ⅱ差异不明显；处理Ⅱ组血液铜含量继续明显增加(P<0.01)，明显高于处理Ⅰ组(P<0.01)，处理Ⅰ组钼含量明显降低(P<0.01)，其他元素无明显差异，如表5所示。

表1 土壤和牧草矿物质元素含量Table 1 The mineral content in soil and forage (μg·g-1)

注：同行上标不同小写字母表示相同指标与对照组比较差异显著(P<0.05)，同行上标不同大写字母表示相同指标与对照组比较差异显著(P<0.01)，下同。
Note: With different small letter superscripts within a line indicate significant differences at 0.05 level as compared with the control; with different capital letter superscripts within a line indicate significant differences at 0.01 level as compared with the control. The same below.

表2 放牧乌蒙半细毛羊血液和肝脏中矿物质元素含量Table 2 The mineral content in blood and liver of semi-fine wool sheep (μg·g-1)

表3 铜污染草地对放牧乌蒙半细毛羊血液指标的影响Table 3 Effect of copper pollution meadow on hematological values of semi-fine wool sheep

注：Hb、RBC、PCV、MCV、MCH、MCHC和WBC表示血红蛋白、红细胞数、红细胞压积、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量、平均红细胞血红蛋白浓度和白细胞数；SOD、CAT、GSH-Px、Cp、MDA、CPK和GOT表示超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱苷肽过氧化物酶、铜蓝蛋白、丙二醛、磷酸肌酸激酶和天门冬氨酸氨基转移酶。
Note: Hb, RBC, PCV, MCV, MCH, MCHC and WBC stand for hemoglobin, red blood cell count, packed cell volume, mean corpuscular volume, mean corpuscular hemoglobin, mean corpuscular hemoglobin concentration and white blood cell count; SOD, CAT, GSH-Px, Cp, MDA, CPK and GOT stand for superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, ceruloplasmin, malondialdehyde, creative phosphokinase and glutamic oxaloacetic transaminase.

表4 铜污染对羊毛产量和品质的影响Table 4 Effect of copper pollution meadow on the yield and quality of wool

表5 补充硫对血液矿物质元素含量的影响Table 5 Effect of sodium sulfate supplement on mineral contents of blood (μg·g-1)

2.2.2 矿物质元素补充对动物血液指标的影响

矿物质元素补充试验结束时，处理Ⅰ组Hb、PCV、RBC和MCV显著高于处理Ⅱ组(P<0.01)，同时也显著高于试验开始时(P<0.01)。WBC无明显差异；处理Ⅱ组Hb、PCV和RBC显著低于试验开始时，并出现溶血性贫血，如表6所示。

2.2.3 补充硫对肝脏矿物质含量的影响

矿物质元素补充试验结束时，处理Ⅰ组肝铜含量基本达到正常范围，显著低于补充试验开始时(P<0.01)，同时明显低于对照组(P<0.01)，肝脏钼含量明显低于补充试验开始时(P<0.01)。处理Ⅱ组在补充试验完成时，肝脏铜含量明显高于试验开始时(P<0.01)，肝脏钼的含量明显低于试验开始时(P<0.05)。其他元素无明显差异，如表7所示。

3 讨论(Discussion)

重金属污染已成为世界各地关注的焦点，重金属污染治理方法和机理研究是环境科学领域的研究重点[13-15]，充分利用元素间的相互作用降低重金属污染对动物的影响是治理重金属污染的有效措施之一[16-21]。铜污染草地放牧，显著增加了血液和肝脏的铜含量，动物出现溶血性贫血，严重影响了动物的生长发育。在硫元素补充试验中，通过硫和铜的相互作用，有效降低了血液和肝脏的铜含量，但对生长发育没有明显的改善，笔者认为，硫补充试验只有15 d，动物还在中毒状态的恢复中，如果开展长期的试验一定会有效改善试验动物生长状况，但进一步的研究亟待开展。

3.1 铜污染草地放牧对血液和肝脏矿物质含量的影响

乌蒙半细毛羊是乌蒙山区的主要畜种，其栖息地重金属污染十分普遍[20-23]。动物组织的重金属主要来自土壤和牧草，引起动物重金属中毒的原因主要包括2个方面：一是牧草重金属含量太高所引起动物组织重金属含量超标；二是元素间相互作用引起的某些元素过剩[22-25]。在研究中，铜污染草地土壤和牧草铜含量显著高于对照组(P<0.01)，同时也显著高于正常范围，通过食物链对放牧动物造成严重的危害，引起血液和肝脏铜的含量明显高于对照组，试验组动物肝脏铜含量是对照组的4.2倍，肝脏是动物贮存铜的主要器官，铜含量高可损伤肝细胞核、线粒体及肝浆液的亚细胞结构，从而引起肝功能异常[26-28]。

表6 补充硫对血液指标的影响Table 6 Effect of sodium sulfate supplement on hematological values

表7 补充硫对肝脏矿物质元素含量的影响Table 7 Effect of sodium sulfate supplement on mineral contents in liver (μg·g-1)

3.2 铜污染草地放牧对动物血液指标的影响

试验结束时，铜污染草地放牧动物的Hb、PCV和RBC显著低于对照组(P<0.01)，MCV显著低于对照组(P<0.05)，出现溶血性贫血。当血液铜明显升高时，肝脏从血液中摄取大量的铜，如果超过其耐受限度，则可抑制多种酶的活性、导致肝细胞变性坏死，排铜功能障碍，当肝脏铜浓度过高，又大量释放铜进入血液，然后进入红细胞，胞内铜浓度不断升高，从而降低红细胞中谷胱甘肽浓度，使红细胞脆性增加而发生管内溶血，溶血时，肾铜浓度升高，肾小管被血红蛋白阻塞，肾单位坏死，导致肾功能衰竭和血尿[29-34]。如肝细胞能再生并足以吸收已死亡肝细胞所释放的铜，则临床不表现症状和溶血，即使肝内铜含量很高也是如此。如肝细胞不能有效再生，将促使铜快速进入血液，血浆铜水平升高，红细胞大量破坏发生溶血，溶血反过来又加速肝坏死，释放更多的铜进入血液，周而复始，引起溶血性贫血[26,33,35]。

3.3 铜污染草地放牧对羊毛品质和产量的影响

试验组产毛量、羊毛的长度显著低于对照组(P<0.01)。硫是动物最主要的营养元素之一，也是蛋白质的主要组成部分[34]。羊毛包括鳞片层、皮质层和髓质层，主要成分是蛋白质，因此羊毛的生长需要大量的硫。在研究中，土壤和牧草的铜含量显著高于正常需要量，在反刍动物的瘤胃、血液和肝脏中的铜都能明显影响硫吸收和利用，高铜的饲料将引起动物硫缺乏，影响羊毛的产量将是必然结果[1-2]。

3.4 硫补充对动物组织和血液指标的影响

无论必需元素，还是非必需元素，当它们在动物体内大量蓄积时，都会对组织和器官产生毒性[32,36-37]。为了避免其毒性作用，动物有抑制摄入、隔离和增强排出等联合调节机制，另外还可以通过调控金属结合蛋白，从而防止或减轻其毒性，逐渐达到解毒的目的[27,38-40]。但重金属间的相互作用也是降低重金属对机体影响的主要措施，硫、钼和铜存在复杂相互关系，在肠道，硫和钼形成硫钼酸盐封闭吸收铜的部位，降低铜吸收。在血液中铜-钼-硫蛋白复合物较稳定，铜不易为组织所利用[41-43]。在肝脏中，硫钼酸盐能直接将铜从金属硫蛋白上剥离下来，剥离后的铜以小分子物质进入血液和胆汁，金属硫蛋白则又从其他蛋白上将铜转移补充，然后再剥离，这样循环，最终使动物铜贮备逐渐减少，最终降低血液铜含量，减少铜污染的毒性[44-47]。在笔者的研究中通过补充硫酸钠达到了降低肝铜和血铜的目的，补充试验结束时，动物血液指标恢复了正常。