仙灵脾改善小鼠睡眠功效成分的分离鉴定

侯云飞 徐德平

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

仙灵脾又名淫羊藿、千两金、放杖草等，为小檗科淫羊藿属多年生多种草本植物的根的统称，被卫生部确定可用于保健食品的原料，首载于《神农本草经》，具有延缓衰老[1]、增强记忆[2]、激素及免疫调节[3]等功效。目前国内外对仙灵脾的报道很多，主要集中在抗疲劳方面[4]，但严金玲等[5]研究表明仙灵脾水提物具有中枢神经系统抑制作用，抑制小鼠自发活动，同时缩短睡眠潜伏期，延长睡眠时间。付立波等[6]利用脑立体定位技术进行仙灵脾总黄酮(TFE)的侧脑室微量注射，通过多导睡眠描记术(PSG)对大鼠睡眠进行观察，结果表明TFE可促进睡眠，一直觉醒，即TFE具有明显的中枢抑制作用[7]。

现有的相关研究着重于仙灵脾的粗提取物上，有关仙灵脾助眠具体功效成分未见报道。试验旨在运用色谱分离及小鼠睡眠[8]、自主活动[9]试验，从仙灵脾中筛选出助眠的功能成分，为仙灵脾作为助眠药物的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

仙灵脾：市售；

无水乙醇、浓硫酸、茴香醛、冰醋酸、正丁醇、二甲亚砜等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

甲醇：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；

硅胶板：GF254，山东烟台芝罘化工厂；

AB-8型大孔吸附树脂：天津南开大学化学工厂；

中压色谱分离凝胶(MCI GEL)填料：三菱化学公司；

C18色谱柱(ODS)填料：日本Tosoh公司；

雌雄ICR小鼠(体重18～22 g)：上海斯莱克动物实验动物有限公司；

试验用水为去离子水。

1.1.2 主要仪器设备

龙视安摄像头：LS-Q130W-1型，广东东莞市盛鼎电子科技有限公司；

磨粉机：GLF-205型，浙江省温州市创立药材器械厂；

萃取罐：RAT-100型，无锡申科仪器有限公司；

旋转蒸发器：R-1002型，上海申顺生物科技有限公司仪器厂；

数显恒温水浴锅：HH-4型，江苏省金坛市荣华仪器厂；

恒流泵：SYB106-100型，天津市科器高新技术公司；

暗室紫外投射仪：ZF-90型，上海顾顺电光仪器厂；

核磁共振仪：Avance 500 MHz型，德国Bruker公司。

1.2 试验方法

1.2.1 仙灵脾提取物制备与粗分离 称取仙灵脾10 kg，粉碎后过40目筛，置于100 L提取罐，按1∶10(g/mL)料液质量体积比加入体积分数70%乙醇，60 ℃条件下搅拌提取4 h，过滤，取滤液，滤渣按上述方法再次醇提，取滤液。合并两次滤液，减压浓缩至适宜体积，即为仙灵脾乙醇提取物，-20 ℃下冷冻保存。向仙灵脾醇提后的滤渣中按上述方法加100 L 去离子水，并于70 ℃条件下搅拌4 h，重复提取两次，过滤，取滤液减压浓缩至膏状物，即为仙灵脾水提物。将仙灵脾醇提物和水提物合并，即为仙灵脾混合提取物。

取适量仙灵脾混合提取物上AB-8型大孔树脂柱(10 cm×150 cm)[10]，依次用水和30%，50%，70%的乙醇进行梯度洗脱，薄层色谱法(TLC)跟踪监测洗脱液中的成分，并根据TLC检测结果将具有相同成分的洗脱液合并，将洗脱液分成A(水洗脱)、B(30%洗脱)、C(50%洗脱)和D(70%洗脱)4个部分。分别减压浓缩后，-20 ℃下冷冻保存备用。

1.2.2 仙灵脾粗分物改善睡眠的作用 试验100只SPF级ICR小鼠，雌雄兼用，体重为(18±4)g，许可证编号SYXK(苏)2016-0045。适应性饲养1周后，随机分为5组，每组20只。试验组以1.0 g/kg·BW剂量分别一次性灌胃A、B、C、D，空白组灌胃同体积蒸馏水，连续灌胃14 d后，展开试验。试验在24～25 ℃安静环境下进行。

(1)自主活动仪测试试验：于末次给药30 min后，将小鼠置于自主活动仪内，适应5 min后测定小鼠10 min内活动次数，自主活动记录仪记录小鼠活动次数及站立次数，作为评价小鼠活动情况的指标[11]。

(2)直接睡眠试验：参照胡超群等[12]的方法进行直接睡眠试验。自主活动试验24 h后进行直接睡眠试验[13]，于末次给药30 min后观察动物是否出现睡眠现象，记录30 min内各组入睡动物数及12 h小鼠睡眠时间。

1.2.3 大孔树脂洗脱活性组分的分离 将含有改善睡眠功效的B组分上样到MCI柱(5 cm×100 cm)，依次用20%，30%，40%的乙醇进行梯度洗脱，流速8 mL/min，自动收集器每管20 mL收集洗脱液，用TLC法跟踪检测洗脱液中的成分[14]，根据Rf值和显色反应的结果，分析合并相同组分，得到L(20%)、M(30%)和N(40%)3个组分。

1.2.4 MCI柱各洗脱组分改善睡眠活性的检测 按1.2.2 方法对MCI柱分离得到的L、M、N进行动物试验，分析各组分改善睡眠的作用。

1.2.5 改善睡眠活性成分的分离与鉴定 将具有改善睡眠活性的M组分反复上样到ODS-D柱(3 cm×100 cm)、ODS-A柱(3 cm×100 cm)和 ODS-AQ 柱(3 cm×100 cm)，直至得到4个单体成分，用氘代二甲亚砜溶解进行1H NMR和13C NMR等光谱数据分析，确定其结构。

1.2.6 单体成分改善睡眠的功效 将4个单体成分按2.2 的方法进行动物试验，判定4个单体成分的改善睡眠功效。

1.2.7 统计学处理 试验结果以SPSS 24.0软件进行统计学分析，试验数据用(x±s)表示，采用One Way-ANOVA检验，直接睡眠试验以入睡动物计数资料并经x2检验。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂粗分物改善睡眠活性分析

经灌胃14 d后，大孔树脂粗分物各组小鼠睡眠率、睡眠时间及自主活动情况的测定结果见表1。由表1可知，各给药组中，B组较空白组30 min入睡率有显著提高(P<0.05)，睡眠时间明显延长(P<0.05)，延长率达到17.38%；在自主活动方面，B组小鼠活动次数和站立次数显著低于空白组(P<0.05)，其中雄鼠活动次数极显著减少(P<0.01)。说明B(大孔树脂30%乙醇洗脱组分)组具有改善睡眠的活性成分，并且该组分对雌雄鼠都具有一定的作用。因此，对大孔树脂30%乙醇洗脱物进一步分离纯化。

2.2 MCI柱各洗脱组分改善睡眠活性的检测

大孔树脂30%乙醇洗脱物MCI分离后的各组分改善睡眠功效见表2。以30 min内入睡动物为计数资料，结果经x2检验，只有M组与空白组有显著性差异(P<0.05)。经One-Way ANOVA检验，发现仅M组较空白组睡眠时间增长，有极显著性差异(P<0.01)。且M组与空白组活动次数及站立次数相比较，呈现显著性差异(P<0.05)。其他各组较空白组均无显著性差异(P>0.05)。雌雄鼠均无差异。故可判定仙灵脾改善睡眠功效成分主要存在于MCI柱层析30%乙醇洗脱物中。

2.3 单体成分的鉴定

MCI柱层析分离得到具有助眠活性的M组分，经进一步分离得到4个主要成分单体。成分Ⅰ为黄色粉末状，可溶于水、乙醇和甲醇；成分Ⅱ黄色粉末状，可溶于水、乙醇和甲醇；成分Ⅲ黄色粉末状，可溶于水、乙醇和甲醇；成分Ⅳ黄色粉末状，可溶于水、乙醇和甲醇。

表1 仙灵脾各组分对小鼠睡眠和活动情况的影响†

† *.与空白组相比差异显著(P<0.05)；**.与空白组相比差异极显著(P<0.01)。

表2 仙灵脾各组分对小鼠睡眠和活动情况的影响†

† *.与空白组相比差异显著(P<0.05)；**.与空白组相比差异极显著(P<0.01)。

由表3可知：

(1)成分Ⅰ：δ7.96，7.17各有2H，形成AA′BB′系统，表明含有苯环对位取代，δ6.68为单峰H，δ5.43，5.21，5.18为糖的端基H信号，说明成分含有3个糖基，δ3.90 为OMe，δ1.75、1.64，1.14，0.85共有4个甲基信号。成分Ⅰ共有38个碳信号，其中糖上18个碳信号，并有1个异戊烯基，余下15个碳信号，推测为黄酮类成分，参照文献[15]鉴定为朝藿定C。

(2)成分Ⅱ：δ7.90，7.13各有2H，δ6.64 为单峰H，δ5.29，5.17，5.01为糖的端基H信号，说明成分含有3个糖基，δ3.86为OMe，δ1.69，1.61，0.81为3个。成分Ⅱ共有37个碳信号，其中糖上17个碳信号，并有1个异戊烯基，余下15个碳信号，推测为黄酮类，该成分与成分Ⅰ相似，不同的是连接的糖链不同，含有1个木糖基，参照文献[16]鉴定为朝藿定B。

(3)成分Ⅲ：δ7.91，7.14各有2H，δ6.64 为单峰H，δ5.18，5.02为糖的端基H信号，说明成分含有2个糖基，δ3.86 为OMe，δ1.69，1.62，0.82为3个甲基信号。成分Ⅲ共有32个碳信号，其中糖上12个碳信号，并有1个异戊烯基，余下15个碳信号，推测为黄酮类成分，该成分与成分Ⅰ相似，不同的是只有2个糖基信号，参照文献[17]鉴定为淫羊藿苷。

(4)成分Ⅳ：δ7.98，7.22各有2H，δ6.69为单峰H，δ5.07为糖的端基H信号，说明成分含有1个糖基，δ3.96为OMe，δ1.71，1.69为2个甲基信号。成分Ⅳ共有26个碳信号，其中糖上6个碳信号，并有1个异戊烯基，余下15个碳信号，应为黄酮类成分，该成分与成分Ⅰ相似，不同的是只有1个糖基信号，参照文献[18]鉴定为淫羊藿次苷。

朝藿定C的R基为Rha-Rha；朝藿定B的R基为Rha-Xyl；淫羊藿苷的R基为Rha；淫羊藿次苷R基为H

图1 4种成分的化学结构

Figure 1 The chemical structures of compounds I，II，III and Ⅳ

表3 成分I、II、III、Ⅳ 的13C 核磁共振数据

2.4 对单体成分改善睡眠功效分析

从表4可以看出，与空白组相比，成分Ⅱ和Ⅳ在睡眠及自主活动指标方面均无显著性差异(P>0.05)；成分Ⅰ雌雄鼠睡眠率提高了10%，雌雄鼠睡眠时间分别延长了117.3，136.9 min(P<0.01)，雌雄鼠活动次数分别减少88.9，88.8次(P<0.05)，雌鼠站立次数减少69.8次(P<0.05)，且雄鼠的站立次数极显著减少95次(P<0.01)；成分Ⅲ雌雄鼠均可显著提高入睡率，延长睡眠时间，抑制小鼠自主活动次数(P<0.05)。说明成分Ⅰ(朝藿定C)具有显著改善睡眠作用，成分Ⅲ(淫羊藿苷)也有较好的作用。

表4 4种成分对小鼠睡眠和活动情况的影响†

† *.与空白组相比差异显著(P<0.05)；**.与空白组相比差异极显著(P<0.01)。

近年来大量文献[19-21]报道仙灵脾具有预防阿尔茨海黙症和改善学习记忆的作用，这种改变与神经和中枢胆碱能系统有着密切的关系。同样睡眠的变化与中枢神经是相关的，试验结果反映出仙灵脾具有影响中枢神经功能，与付立波等[22]认为仙灵脾增加中枢的γ-氨基丁酸(GABA)含量或抑制GABA转氨酶的活性，均可增加深睡眠和减少快速眼动睡眠研究结论相似。

3 结论

仙灵脾提取物大孔树脂30%乙醇洗脱组分具有促进睡眠功能，该组分经MCI分离发现，改善睡眠功效成分集中在30%洗脱物中，对其进一步分离得到4个单体成分分别是朝藿定C、朝藿定B、淫羊藿苷、淫羊藿次苷，经直接睡眠试验和自主活动测试明确成分朝藿定C和淫羊藿苷均可提高小鼠入睡率、延长睡眠时间及抑制自主活动次数，说明其具有改善睡眠的功效。

有关仙灵脾对神经系统的作用，大部分研究者[23-24]认为淫羊藿苷起主要作用，试验发现改善睡眠的功能成分主要为朝藿定C，而不是淫羊藿苷。该化合物在体内可以通过增加中枢神经的γ-氨基丁酸(GABA)含量或是抑制GABA转氨酶的活性产生作用，具体是哪种作用机制有待进一步研究。