阿魏酸及其烷基酯在水包油乳液中抗氧化效率的假相模型解释

黄师荣 万 慧 颜思念 陈东方

(湘潭大学生物与食品工程系，湖南 湘潭 411105)

食品中的脂类氧化会产生腐臭味和异味，降低保质期，改变食品质地和外观，降低食品的营养价值和安全性，是食品腐败变质的原因之一[1]。食品乳液(如牛奶、蛋黄酱、调味品、酱汁、饮料、冰淇淋等)由于表面积更高，比油脂更容易被氧化[2-3]。目前，降低脂类氧化的最有效、最方便和最经济的方法是添加天然或合成抗氧化剂[1]。

酚酸在自然界广泛存在，由于能阻止或延缓体外或体内氧化过程，被广泛用作新型的天然抗氧化剂[4]。但是酚酸极性较高，易于在水相优先聚集，远离脂肪氧化发生的油/水界面，限制了其在乳化体系中的应用[5]。为此，近年来有人[6]对其进行了酯化修饰，以增强其疏水性，使其能更好地定位于氧化反应发生的油水界面，从而改善其在乳化体系中的抗氧化性能和效率。然而，许多研究[1,7-10]表明用不同链长的正烷基醇酯化的酚酸在乳液中的抗氧化效率会随着其疏水性增加而达到最大，进一步增加其疏水性则其抗氧化效率显著降低，表现出所谓的“截止效应”。对于其背后的原因依旧不太清楚。Costa等[10]用假相动力学模型解释了咖啡酸及其烷基酯(C1～C16)随着疏水性增加抗氧化效率达最大值的原因，还发现咖啡酸及其烷基酯的抗氧化效率与其在乳液界面区域的百分数相对应。在其他条件都相同的情况下，乳液界面区域中百分数最大的抗氧化剂其效率最高。

为验证这一模型的适用性，试验拟研究与咖啡酸结构比较类似的阿魏酸(FA)及其烷基酯在均相甲醇溶液中和菜籽油乳液中的抗氧化效率。用假相动力学模型测定和计算FA及其烷基酯在乳液界面中的分布，旨在为特定乳液体系确定最有效的抗氧化剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阿魏酸(纯度97%)、对甲基苯磺酸(质量分数≥99.0%)、对十六烷基苯胺(纯度97%)、亚硝酸叔丁酯(纯度90%)、三氟化硼乙醚(纯度98%)、盐酸萘乙二胺(分析纯)、正十二醇(质量分数>98.0%)：上海麦克林生化科技有限公司；

Trolox：纯度97%，美国Sigma公司；

DPPH：纯度96%，日本和光纯药工业株式会社；

分子筛、硅胶(200～300目)、活性炭(200目)：国药集团化学试剂有限公司；

其他试剂均为市售分析纯；

菜籽油：湘潭大学工会购物中心。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计：Agilent Cary60型，安捷伦科技(中国)有限公司；

pH计：PHS-3BW型，上海般特仪器有限公司；

三用紫外分析仪：ZF-7型，上海杰涵实验设备有限公司；

高速分散均质机：FJ-2000型，上海标本仪器厂；

核磁共振波谱仪：AVANCE III HD 400MHZ型，瑞士布鲁克公司；

傅里叶红外光谱仪：NICOLET 380型，美国尼高力公司。

1.3 试验方法

1.3.1 阿魏酸烷基酯的合成及表征 参考Sorensen等[11]的方法，稍作修改，其合成路线如图1所示。将15.4 mmol 阿魏酸溶解于150 mL四氢呋喃(THF)中。将醇以1 mol阿魏酸与3 mol醇的摩尔比添加到阿魏酸的THF溶液中，再加入浓硫酸(最终体积分数为5%)做催化剂，最后加入40 mg/mL的分子筛以除去反应中产生的水分。将反应物置于震荡器中，在250 r/min，55 ℃的条件下避光反应5～7 d。反应结束后，除去分子筛，蒸发THF，并将反应混合物在乙酸乙酯中稀释。将所得溶液用质量分数为5%的NaHCO3溶液和水洗涤数次并用硫酸钠干燥以除去痕量的水。然后，通过快速色谱法(以二氯甲烷和乙酸乙酯做洗脱剂进行梯度洗脱)去除剩余的醇和阿魏酸。

图1 几种阿魏酸烷基酯的合成路线

所得产物分别用TLC、1HNMR、FTIR进行表征。

1.3.2 DPPH自由基清除能力测定 参考Claudia等[12]的方法进行，稍作修改。用甲醇做溶剂分别配制浓度为150 μmol/L的DPPH溶液和浓度为600 μmol/L的6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)溶液，然后将Trolox溶液再稀释成浓度分别为250，200，150，100，50 μmol/L 的溶液。分别取0.5 mL Trolox稀释液和4.5 mL DPPH甲醇溶液混合，振摇，置于暗处120 min后，用甲醇做空白，在515 nm处测吸光度。以Trolox浓度为横坐标，吸光度为纵坐标建立标准曲线，曲线斜率记为k1。取FA及其烷基酯样品代替Trolox试剂，同上步骤，建立以样品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标的标准曲线，曲线斜率记为k2。样品的DPPH自由基清除能力(ARA)以Trolox当量(mol Trolox/mol)表示，按式(1)计算。重复测定3次，结果取平均值。

ARA=k2/k1。

(1)

1.3.3 阿魏酸及其烷基酯对水包油乳液抗氧化效率的测定 参考李进等[13]的方法。

1.3.4 无乳化剂下阿魏酸及其烷基酯在油相和水相之间分配常数的测定 参照文献[14]的方法。按式(2)计算抗氧化剂在油相和水相之间的分配常数值。

(2)

(3)

(4)

式中：

%AOO、%AOW——分别为抗氧化剂在油相和水相的摩尔分数；

VW、VO——分别为水相和油相的体积，L；

(AOO)、(AOI)、(AOW)——分别为油相区、界面区和水相区中AO的摩尔浓度，mol/L。

ln(At-Ainf)=-kobst+ln(A0-Ainf)，

(5)

式中：

kobs——表观速率常数，s-1；

A0、At——分别为样品在0和t时刻的吸光度；

Ainf——样品反应完全时的吸光度。

(6)

式中：

kI——界面区域中二级速率常数，L/(mol·s)；

[]——乳液中各物质的浓度，mol/L；

下标T——总量；

下标O、I和W——分别为油相区、界面区和水相区；

Φ——某个区域的体积分数。

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

1.3.7 数据分析 采用SPSS 19.0统计软件包、OriginPro 8和Excel 2007进行数据分析和处理，所有试验均重复3次，结果表示为：平均值±标准差。显著性检验(P<0.05)以Duncans检验方法进行。

2 结果与分析

2.1 阿魏酸烷基酯的合成及结构表征

阿魏酸乙酯(FA-C2)1H NMR(400 MHz，Acetone-d6)，δ：7.59(d，J=15.9 Hz，1H)，7.34(d，J=2.0 Hz，1H)，7.14(dd，J=8.2，2.0 Hz，1H)，6.88(d，J=8.2 Hz，1H)，6.39(d，J=15.9 Hz，1H)，4.19(q，J=7.1 Hz，2H)，3.92(s，3H)，1.28(t，J=7.1 Hz，3H)。FTIR ν：3 405，2 980，2 842，1 703，1 632，1 603，1 514，1 429，1 270，1 178，1 034，847，818 cm-1。

阿魏酸丁酯(FA-C4)1H NMR(400 MHz，Acetone-d6)，δ：7.60(d，J=15.9 Hz，1H)，7.33(d，J=2.0 Hz，1H)，7.14(dd，J=8.2，2.0 Hz，1H)，6.88(d，J=8.2 Hz，1H)，6.40(d，J=15.9 Hz，1H)，4.15(t，J=6.6 Hz，2H)，3.92(s，3H)，1.66(ddt，J=8.9，7.8，6.4 Hz，2H)，1.51～1.29(m，2H)，0.95(t，J=7.4 Hz，3H)。FTIR ν：3 405，2 955，2 875，1 700，1 630，1 599，1 516，1 455，1 269，1 170，1 032，848，817 cm-1。

阿魏酸辛酯(FA-C8)1H NMR(400 MHz，Acetone-d6)，δ：7.60(d，J=16.0 Hz，1H)，7.34(d，J=2.0 Hz，1H)，7.14(dd，J=8.2，2.0 Hz，1H)，6.87(d，J=8.1 Hz，1H)，6.40(d，J=15.9 Hz，1H)，4.15(t，J=6.7 Hz，2H)，3.93(s，3H)，1.79～1.62(m，2H)，1.51～1.17(m，10H)，0.88(d,J=7.0 Hz, 3H)。FTIR ν：3 417，2 930，2 857，1 704，1 629，1 598，1 513，1 458，1 269，1 168，1 031，848，817 cm-1。

阿魏酸十二酯(FA-C12)1H NMR(400 MHz, Acetone-d6)，δ：8.11(s，1H)，7.50(d，J=15.9 Hz，1H)，7.26(d，J=1.9 Hz，1H)，7.05(dd，J=8.2，2.0 Hz，1H)，6.78(d，J=8.2 Hz，1H)，6.31(d，J=15.9 Hz，1H)，4.05(t，J=6.7 Hz，2H)，3.83(s, 3H)，1.59(p，J=6.7 Hz，2H)，1.44～1.00(m, 18H)，0.78(t，J=6.6 Hz，3H)。FTIR ν：3 402，2 928，2 856，1 703，1 630，1 594，1 514，1 460，1 265，1 163，1 031，847，818 cm-1。

将上述数据与文献[17-18]数据进行对比，确认所得产物分别为阿魏酸乙酯、丁酯、辛酯和十二酯。

2.2 DPPH自由基清除能力

表1给出了FA及其烷基酯在均相甲醇溶液中的抗氧化效率。由表1可以看出，FA及其烷基酯的DPPH自由基清除能力大小顺序为FA>FA-C12>FA-C8>FA-C4≈FA-C2。FA表现出比其烷基酯更强的DPPH自由基清除能力，表明FA的酯化降低了其清除自由基的能力。Sørensen等[11]在用DPPH自由基清除法研究阿魏酸酯的抗氧化性能时也得到相似的结果。据报道[19]，在能够与酚类分子形成强氢键的极性溶剂例如甲醇或乙醇中，抗氧化剂主要通过提供电子来清除自由基。烷基属于弱供电基团，并且烷基链长越长，其供电性越强。因此酚酸及其烷基酯的自由基清除活性一般随烷基链长的增加而增强；但FA烷基酯的自由基清除能力却下降了，其原因有待进一步研究。

表1 阿魏酸及其烷基酯的DPPH自由基清除能力†

† 字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.3 阿魏酸及其烷基酯在水包油乳液中的抗氧化效率

20世纪80年代，Porter提出了极性悖论假说，试图根据抗氧化剂在不同脂类介质中的极性预测抗氧化剂的效率。该假说认为，抗氧化剂在不同脂类介质中的抗氧化效力不同，极性抗氧化剂在极性更低的介质如油脂中更有效，而非极性抗氧化剂在极性更高的介质如水包油乳液或脂质体中更有效[20]。为验证这一假说，研究了FA及其烷基酯(添加浓度为0.004 mol/L)对油与水体积比为2∶8的水包菜籽油乳液中脂质的抗氧化效率，通过CD值达到1所用的时间和AV值的变化趋势来评价FA及其烷基酯对水包油乳液的抗氧化效率，结果分别如图2、3所示。由图2、3可知，FA烷基酯对乳液的抗氧化作用显著大于FA的，并且随着FA烷基酯链的增长，其抗氧化作用逐渐增大，在FA-C8达到最大之后，随着FA烷基酯链的进一步增长，其抗氧化作用减小。这一结果与上述假说并不相符，Costa等[10]在研究咖啡酸及其酯对水包橄榄油乳液的抗氧化效率时也得到类似的结果。Barreiro等[1]认为，酚酸烷基酯的抗氧化活性随着链长增加观察到最大值的根本原因是抗氧化剂在界面区的浓度不同。

图2 不同体积分数吐温20制备的菜籽油乳液中共轭二烯值随时间的变化

图3 不同体积分数吐温20制备的菜籽油乳液中p-茴香胺值(AV)随时间的变化

从图2、3还可以看出，随着吐温20的体积分数从1.0% 增加到4.0%，添加阿魏酸辛酯的乳液的CD值达到1所用的时间分别为51，48，46，43 d；AV值达到6所用的时间分别为40，38，35，31 d，表明随着乳化剂体积分数的增加其抗氧化性能下降了。当吐温20体积分数从1.0% 增加到4.0%时，其体积增加了3倍，即界面区域增加了3倍，但FA-C8在界面区域的质量分数仅由95%增加到99%(见图5)，几乎没有变化。因而，FA-C8在乳液界面区域的平均摩尔浓度下降了。这可能是FA-C8的抗氧化效率随吐温20体积分数增加而下降的原因。Costa等[10]在研究咖啡酸及其烷基酯对橄榄油乳液的抗氧化效率与其在乳液界面区域浓度的关系时也得到类似的结果。此外，随着乳化剂体积分数的增加，4种阿魏酸烷基酯的抗氧化能力相差越来越小。这与图5中4种抗氧化剂在乳液界面区域的浓度差距越来越小相一致。这些结果说明，阿魏酸及其烷基酯在乳液中抗氧化能力的大小主要由其在乳液界面区域的分布决定。

2.4 阿魏酸及其烷基酯在乳液油相、水相和界面之间的分配常数

FA在均相溶液(甲醇)中的抗氧化效率最强，但是在乳液中FA-C8更有效。由于水包油乳液中脂类氧化通常发生在乳液液滴界面附近，因而FA及其烷基酯在乳液中的抗氧化效率不同的可能是由于乳液界面区内的抗氧化剂质量分数不同引起的[1,10]。为找出FA-C8在乳液中最有效的原因，用假相动力学模型法测定了FA及其烷基酯在乳液界面的分布。为此，首先测定了FA及其烷基酯在乳液油相、水相和界面之间的分配常数。

表2 FA及其烷基酯的分配常数值

图4 偶氮染料(λ=572 nm)的吸光度和ln(At-Ainf)随时间的变化

Figure 4 Changes in absorbance and ln(At-Ainf)of the azo dye with time

表3 FA及其烷基酯的表观速率常数kobs随乳化剂体积分数ΦI的变化

2.5 阿魏酸及其烷基酯在乳液界面的分布

由图6可知，FA及其烷基酯在界面区域的百分比随乳化剂体积分数ΦI的增加而增加，在ΦI为5.0%时超过90%的抗氧化剂位于界面区；在任何ΦI下，抗氧化剂在乳液界面区域的百分比大小顺序为：FA-C8>FA-C4>FA-C2>FA-C12>FA。显然，界面区抗氧化剂的百分比并不与抗氧化剂的疏水性直接相关。分析相同ΦI下界面区抗氧化剂百分数随烷基链长度的变化情况，可以看出随着烷基链长度的增加，FA及其烷基酯的%AOI显示出类似抛物线形状，在C8达到最大值。这意味着，在相同乳化剂体积分数下抗氧化剂在界面区的质量分数随着FA烷基酯链长的增加先增加后下降。这些结果表明，乳液界面区中抗氧化剂的质量分数并不与抗氧化剂的疏水性直接相关；中等极性或中等链长的抗氧化剂在界面区的分数达到最大。

表4 FA及其烷基酯的和kI值

图5 FA在油水比为2∶8的菜籽油乳液中的kobs(K)和1/kobs(RK)随ΦI的变化

Figure 5 Changes inkobs(K)and 1/kobs(RK)withΦIfor FA in 2∶8 rapeseed oil/water emulsions

从图6中还可以看出，当ФI从0.5%增加到5.0%时，FA及其烷基酯在界面区域的体积增加了10倍，但%AOI最多只增加了约45%，这意味着FA及其烷基酯在界面的摩尔浓度约降至原来的1/7。AO反应性和效率均取决于其界面摩尔浓度，浓度降低会导致AO效率降低。这是FA及其烷基酯的抗氧化效率随吐温20体积分数增加而下降的原因。这一结果表明，对FA及其烷基酯抗氧化效率起决定性的因素是其在乳液界面区域的质量分数，与其他研究人员研究没食子酸[1]、绿原酸、迷迭香酸[8]和咖啡酸[10]及其烷基酯所得的结果相似，烷基链在中等链长(C4～C12)的抗氧化活性最高，随后AO活性下降，体现出“截止效应”。

图6 FA及其烷基酯在乳液界面区域的质量分数随乳化剂体积分数ФI的变化

Figure 6 Changes in the percentages of FA and its alkyl esters in the emulsion interfacial region with different volume fractions of emulsifier

3 结论

试验研究了FA及其烷基酯在均相甲醇溶液和在水包菜籽油乳液中的抗氧化效率。结果表明，FA在均相甲醇溶液中的抗氧化效率最强，而在菜籽油乳液中FA-C8的抗氧化效率最强。假相动力学模型结果表明，FA及其烷基酯的抗氧化效率与其在乳液界面区域的质量分数相对应。在其他条件都相同的情况下，FA-C8在乳液界面区中质量分数最大。试验结果说明，抗氧化剂在乳液中的抗氧化效率主要与其在乳液界面的质量分数有关；在其他条件都相同的情况下，阿魏酸及其烷基酯在乳液中最有效的是在界面区中百分比最大的。