QuEChERS-UPLC-Q/Orbitrap MS法快速测定草鱼中14种糖皮质激素类药物残留
2019-04-16孙桂芳周兴旺
李 涛 杨 潇 孙桂芳 宋 阳 周兴旺
(1.湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410111；2.长沙商贸旅游职业技术学院，湖南 长沙 410004)
水产品中药物残留一直是社会的关注热点。糖皮质激素是由肾上腺皮质中束状带分泌的一类甾体激素，属于固醇类激素，能调节脂肪、蛋白质等生物合成与代谢，具有抑制免疫应答、抗炎、抗过敏、抗毒素等作用[1-2]，广泛应用于人类医疗。糖皮质激素还可以提高蛋白转换率，促进动物生长，一些饲养者在畜禽养殖过程中非法过量使用该药物，导致水产品中药物残留[3]。为保障食品安全，农业部第235号公告规定，水产品中不得检出糖皮质激素类药物残留。
目前，糖皮质激素类测定法主要有高效液相色谱法[4-5]、液质联用法[6-9]、微生物法[8]、毛细管色谱法[9]等。高效液相色谱法灵敏度低，选择性差；微生物法方便快速，但易出现假阳性，且通量小，群选性差；毛细管色谱法虽提高了液相色谱法灵敏度，但仍存在灵敏度低，通量小等问题；液质联用法具有高灵敏度、高选择性、高通量等特点，是药物残留分析最常用手段之一。四级杆/轨道阱高分辨质谱是依据静电场轨道阱技术发展起来的新式质谱[10]，具有高分辨率、高质量精度、高稳定性等特点，已应用于农药残留分析[11]、兽药残留分析[12-13]和食品非法添加[14]等领域。
试验拟利用四级杆/轨道阱高分辨质谱联用系统，结合QuEChERS快速提取净化技术，建立草鱼中14种糖皮质激素类药物残留的快速检测方法，以期提供一种利用高分辨质谱测定药物残留的方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生鲜草鱼：市售；
Hypersil Gold色谱柱：150 mm×2.1 mm，3 μm，美国Thermo Fisher Scientific公司；
乙腈、甲醇：色谱纯，美国 Merck公司；
甲酸：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；
PSA萃取剂：40～63 μm，60A，德国CNW公司；
C18萃取剂：40～63 μm，德国CNW公司；
无水硫酸镁：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；
氟米松(CAS 426-13-1，99.8%)、倍氯米松(CAS 4419-39-0，98.5%)、安西奈德(CAS 51022-69-6，99.5%)、氟米龙(CAS 426-13-1，97.9%)、醋酸氢化可的松(CAS 50-03-3，99.5%)标准品：北京曼哈格生物科技有限公司；
醋酸地塞米松(CAS 1177-87-3，100%)、布地奈德(CAS 51333-22-3，100%)、醋酸氟氢可的松(CAS50-03-3，99.7%)、醋酸泼尼松(CAS 125-10-0，100%)、倍他米松(CAS 378-44-9，100%)、氢化可的松(CAS 50-23-7，100%)、泼尼松(CAS 53-03-2，100%)、曲安奈德(CAS 76-25-5，100%)、地塞米松(CAS 50-02-2，100%)标准品：德国Dr公司。
1.2 仪器与设备
四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱：Q Exactive Focus型，美国Thermo Fisher Scientific公司；
超高效液相色谱：Ultimate 3000型，美国Thermo Fisher Scientific公司；
电子分析天平：BS224S型，德国赛多利斯公司；
冷冻离心机：X1R型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；
高速振荡器：CM-1000型，东京理化器械株式会社。
1.3 液相色谱条件优化
在相同洗脱程序和色谱柱条件下，选择超纯水、体积分数0.1%甲酸溶液、体积分数0.1%甲酸—乙酸铵溶液(5 mmol/L)为无机流动相，考察分离效果。色谱柱Hypersil Gold C18(150 mm×2.1 mm，3 μm)，流动相A为无机流动相，流动相B为乙腈；采用梯度洗脱模式(表1)进样；流速0.2 mL/min；柱温35 ℃；进样体积5 μL。
1.4 质谱条件优化
在HESI离子源下，采用PRM/Targeted-MS2扫描，扫描范围(m/z)50～550，分辨率35 000，毛细管电压3 000 V；电喷雾离子源温度320 ℃，气化温度350 ℃；鞘气压0.24 kPa；辅助气压0.091 kPa；离子传输管温度320 ℃；喷雾电压4.0 kV。取单一标准溶液直接进样，依据化合物分子量，在四极杆质量分析器进行Full MS扫描，依据化合物响应值高低选择化合物分析模式。
表1 梯度洗脱程序
1.5 样品前处理
1.5.1 提取剂优化 取可食用部分混匀，精密称取混匀后样品2.0 g于50 mL离心管中，分别加入甲醇、乙腈、体积分数1%甲酸—乙腈、体积分数2%甲酸—乙腈25.0 mL，振荡摇匀30 min，冷冻离心，取1.5 mL上清液加入50 mg PSA+100 mg无水硫酸镁+100 mg C18萃取剂，振荡混匀后高速离心，过0.22 μm滤膜，上机测定目标物回收率。
1.5.2 净化条件优化 在相同提取条件下，1.5 mL上清液中加入PSA、C18和无水硫酸镁净化组合进行净化，净化组合分别为A(100 mg C18+50 mg PSA+100 mg无水硫酸镁)、B(100 mg C18+50 mg PSA)、C(50 mg C18+100 mg PSA+100 mg无水硫酸镁)、D(75 mg C18+75 mg PSA+100 mg无水硫酸镁)，振荡混匀后高速离心，过0.22 μm滤膜，上机测定目标物回收率。
1.6 线性范围、检出限和定量限测定
按1.5制备空白基质溶液，以基质溶液为稀释液，配制2.0～100.0 ng/mL基质标准溶液，以峰面积的响应值Y为纵坐标，标准溶液浓度X(ng/mL)为横坐标，外标法制作标准曲线。在空白草鱼样品添加低浓度混合标准溶液，按样品制备方式处理，进液质联用仪检测，以信噪比≥3的浓度为检出限，信噪比≥10的浓度为定量限。
1.7 准确度和精密度测定
在空白草鱼样品中加入糖皮质激素混合标准溶液，加标后样品浓度分别为20.0，40.0，200.0 μg/kg，每个浓度样品制备6份，测定14种糖皮质激素的含量，计算回收率和RSD值。
1.8 草鱼样品检测
依据上述得出的最优样品制备方式处理草鱼样品，质谱采集数据采用保留时间进行定性，结合离子丰度比和二级特征离子进行确证，在最优仪器条件下检测草鱼中14种糖皮质激素含量。
2 结果与讨论
2.1 质谱条件优化
经扫描得知，14种糖皮质激素化合物在正离子模式下响应值最高，得到目标物母离子信息。通过SIM扫描，设置低、中、高碰撞电压，轨道阱检测子离子信息，14种糖皮质激素质谱参数见表2。
2.2 提取剂优化
由图1可知，体积分数1%甲酸—乙腈提取效果最优，14种糖皮质激素综合回收率较高，甲醇提取效果最差。乙腈具有沉淀蛋白作用，且溶液中微量甲酸可促进糖皮质激素化合物的电离，提高提取效率，而过量甲酸易与净化剂发生反应，降低回收率，影响提取效果。
2.3 净化条件的优化
由图2可知，100 mg C18、50 mg PSA和100 mg无水硫酸镁组合时，基质干扰小，14种糖皮质激素类化合物回收率高。PSA吸附剂可有效去除提取液中脂肪酸、糖类、酚类及极性色素等成分，C18吸附剂去除脂肪和酯类等非极性干扰物，无水硫酸镁能产生盐析效应，降低提取液中亲水成分的溶解度，经高速离心后可去除。在固定体积的提取液中，吸附剂的量会影响目标化合物的回收率，通常1.5 mL提取液单一吸附剂量为100 mg，无水硫酸镁对糖皮质激素无吸附作用，能提高目标化合物的回收率，C18吸附剂对糖皮质激素类化合物吸附较小而回收率较高。
2.4 流动相的选择
试验发现，无机流动相使用超纯水分离峰形较差，响应值较其他两种流动相差，无机流动相选择体积分数0.1% 甲酸溶液和体积分数0.1%甲酸—乙酸铵能有效分离14种糖皮质激素，体积分数0.1%甲酸溶液响应值更高。正离子模式中，加入体积分数0.1%甲酸可显著提高目标化合物电离效果，增强质谱响应，乙酸铵可增强部分化合物响应值，但同时抑制某些化合物响应值，为减少乙酸铵溶液对管路及质谱的污染，采用体积分数0.1%甲酸—乙腈流动相体系。由图3可知，14种化合物得到了有效分离。
2.5 线性范围、检出限和定量限分析
由表3可知，14种糖皮质激素在浓度为2.0～100.0 ng/mL 时，线性关系良好(R2≥0.999)，检出限为1.3～6.0 μg/kg，定量限为4.5～20.0 μg/kg，利用基质溶液配制标准溶液能有效降低基质增强与抑制效应，线性关系良好，能准确检测目标化合物的含量。
表2 14种糖皮质激素的离子选择参数表†
† *定量离子。
图1 不同提取剂对目标物回收率的影响
图2 不同吸附剂组合对目标物回收率的影响
图3 糖皮质激素混合标准溶液定量离子色谱图
2.6 准确度和精密度分析
由表4可知，加标浓度为20.0 μg/kg时，回收率为76.9%～102.5%，RSD为2.3%～6.1%；加标浓度为40.0 μg/kg 时，回收率为80.5%～103.3%，RSD为2.1%～6.2%；加标浓度为200.0 μg/kg时，回收率为87.1%～97.3%，RSD为1.6%～6.3%。依据方法验证要求，回收率浓度通常设置在方法定量限、2倍定量限、10倍定量限附近，试验在低、中浓度回收率为60%～120%，高浓度回收率为80%～110%，RSD<10%，3个梯度加标回收率和精密度良好。
表3 14种糖皮质激素的线性方程、相关系数、检出限和定量限
表4 14种糖皮质激素的回收率和精密度
2.7 实际样品检测
应用试验建立的检验方法对市场采购的30批次鲜活草鱼进行检测，均未检出阳性样品，表明草鱼检出糖皮质激素风险较低，安全性较高。
3 结论
试验建立了超高效液相色谱—四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测水产品中14种糖皮质激素的方法，优化了QuEChERS提取溶剂与吸附剂种类用量，并对线性方程、检出限、定量限、回收率等方法学指标进行了验证。该方法简单高效、灵敏度高，为批量快速检测水产品中糖皮质激素提供参考，也为建立水产品中糖皮质激素类药物残留检测方法提供数据支持。但试验方法所涉及的糖皮质激素种类有限，今后应不断补充完善。
