金樱子丙酮、甲醇、乙醇超声提取物抗EV71和RSV病毒分析

2019-04-15栾菁菁张晓平

山东化工 2019年5期

李菁，朱雪，栾菁菁，张晓平，2*

(1．山东中医药大学药学院，山东济南 250300;2．山东中医药大学青岛中医药科学院，山东青岛 266112)

金樱子又名刺榆子、刺梨子、金罂子、山石榴、山鸡头子、糖罐，为蔷薇科蔷薇属植物金樱子(Rosa laevigata Michx．)的干燥成熟果实。主要产于四川、湖南、广东、江西。10～11月果实成熟变红时采收，干燥，除去毛、刺、核用。其气微，味甘、微涩。以个大，色红黄者为佳。生用。金樱子药性酸、甘、涩、平，归肾、膀胱、大肠经，具有固精缩尿［1］、收敛止泻［2］的功效，主治肾虚精关不固之遗精滑精，膀胱失约之遗尿尿频，冲任不固之崩漏带下，脾虚之久泻久痢。据《本草新编》等典籍记载，“遗精梦遗之症，皆尿窍闭而精窍开，不兼用利水之药以开尿窍，而仅用涩精之味以固精门，故愈涩而愈遗也”，其具有固精缩尿、固崩止带、涩肠止泻等功能。其主要化学成分有多糖、黄酮［3］类物质、三萜类及其衍生物［4］等。金樱子在我国也有较多研究。随着现代科技的不断进步，对金樱子的研究更加深入，对其功效也有了进一步的了解。

本研究立足于在丙酮、甲醇、乙醇溶剂中金樱子提取物含量的测定，通过分析其提取物对于病毒活性的抑制作用，发现金樱子抗病毒作用的优势，为开发金樱子作为抗病毒活性药物奠定基础。

1 仪器及材料

1．1 材料

金樱子药材(购置于漱玉平民大药房，经相关专家鉴定其满足本实验要求)。

1．2 受体细胞以及侵染病毒

Hep2(人喉表皮样癌细胞，为RSV受体细胞)、RD(人横纹肌肉瘤细胞，为EV71受体细胞)、呼吸道合胞病毒、手足口病毒为山东省医学科学院基础医学研究所提供，本实验室培养保存。

1．3 试剂

细胞培养液(美国 HyClone公司，批号:AAJ207653)，含10%新生牛血清及100 U/mL青霉素和链霉素，除菌，分别置于4℃下备用;细胞维持液(美国 HyClone公司，批号:AAJ207653)，含2%新生牛血清及100 U/mL青霉素及链霉素，除菌，分别置于4℃储存备用);新生牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批号:141013);PBS磷酸盐缓冲液(美国HyClone公司，批号:AAK2－8442);EDTA－0．25%胰酶(美国Gibco公司，批号:1737903);CCK－8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，编号:C0039);DMSO(amresco公司，批号:2705C127);丙酮(分析纯)，甲醇(分析纯)，乙醇(分析纯)。

1．4 仪器

CO2恒温培养箱(上海力申科学仪器有限公司，批号:HF90);生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司，批号:HFsafe－1200TE);倒置显微镜(Olympus公司，批号:CKX－31);酶标仪(Molecular Device，Spectra Max M5)。

2 实验方法

2．1 供试品溶液的制备

取4份干燥的金樱子药粉20 g，过60目筛;分别用200 m L水、丙酮、甲醇、60%乙醇超声提取30min，抽滤，滤液干燥，取产物用2%的二甲亚砜溶液配成16 mg/mL的供试品溶液待用。

2．2 药物对细胞毒性的测定

用2%维持液将供试品药物按二倍比稀释10个浓度梯度，在已经长好细胞的96孔板上依次接种，并设置4个复孔、空白对照孔和细胞对照孔，在37℃、5%CO2病毒培养箱中培养，置于倒置显微镜下观察细胞的生长形态，当细胞出现90%的病变时停止培养，每孔加10μLCCK－8进行染色处理，置于37℃、5%CO2培养箱中培养3 h，使用酶标仪在450 nm波长测定吸光度OD值。运用Reed－Muench公式，计算药物半数中毒浓度TC50，并确定细胞存活率在90%以上的最大无毒浓度TC0。

2．3 药物对被侵染细胞作用

供试品从无毒浓度起用2%1640培养基，按二倍比系列稀释10个浓度，以每孔100μL的量接种在已经长成单层细胞的96板孔上，每孔再加100μL100倍TCID50的病毒液，同时设阳性对照组(利巴韦林)、病毒对照组及空白对照组，每组4个复孔，置于37℃、5%CO2病毒培养箱中培养，每隔2 h于倒置显微镜下观察一次细胞对照，待病毒对照出现90%以上的病变时，停止对细胞培养的培养，每孔加10μLcck－8进行染色处理，用酶标仪在450 nm波长测定吸光度A值。应用Reed－Muench公式计算药物半数有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。

EC50=［Antilog(高于50%CPE百分率病毒稀释度的值－比距)］×C

治疗指数(TI)=半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(EC50)

3 实验数据及结果

图1 EV71侵染RD细胞

图2 RSV侵染Hep2细胞

表1 抗病毒作用结果

由表1可知，三种超声提取物对两种病毒均有抑制作用，对EV71的作用效果要优于RSV，其中，60%乙醇超声提取物对两种病毒的抑制作用均较其他两种提取方式好，其TI值分别为6．10和6．19;丙酮超声提取物对两种病毒的抑制作用较差，其TI值分别为4．51 和5．08。

4 讨论

据临床统计，病毒所导致的疾病在所有感染性疾病中所占的比例高达75%以上［5］，因此，抗病毒治疗异常重要。然而，病毒对大多数抗生素等西药并不敏感，而且西药费用昂贵，服用后不良反应也比较大。中医药对病毒具有多重作用，很少产生耐药性，不良反应较小，价格低廉，部分药物还兼有解热、增强机体免疫功能等优势［6］。目前，据有关文献资料报道，抗病毒中药［7］在临床中的应用，几乎已经遍及国内目前常见的病毒感染性疾病，如流行性感冒、传染性肝炎、流行性乙型脑炎、流行性出血热、病毒性心肌炎、病毒性肠炎、流行性腮腺炎等［8］，治疗效果显著。

近年来，随着禽流感病毒感染、流行性出血热、埃博拉(Ebola virus)寨卡病毒等的出现和蔓延，中药抗病毒研究再次成为热点。目前，对中药抗病毒［9］研究主要集中于从中药中分离的化学单体;单味中药及其提取物;中药复方制剂等。从有效成分分布来看，几乎遍及生物碱类、黄酮类、苷类、挥发油、有机酸、氨基酸、酚、醛、鞣质、蛋白质、多糖和单糖等。金樱子水煎液中含有 Mn、Ca、Fe 、Mg 、Cu、Zn、Ni、Cr、Co 9 种微量元素［10］，其中 Mn、Ca、Fe 3种元素具有统计学意义，而其他元素溶出比较少。研究发现金樱子的活性成分主要为有机酸、多糖、黄酮类物质、三萜类及其衍生物等，药理作用主要有抗氧化、抗菌、抗炎、免疫活性、降糖降脂等作用［11］。金樱子是一种药食两用植物［12］，不仅含有糖、酸、蛋白质、维生素等多种营养成分，而且含有类黄酮、多糖和糖苷元、三萜类有机酸、乌所酸、齐墩果酸、儿茶酸、谷甾醇等多种人体生命活性物质和人体生长发育必需的微量元素。人们对金樱子的研究主要集中在药效、制剂等方面，并且研究得不深入。金樱子化学成分复杂，人们对其药理作用及其他成分的研究还较浅。现代药理研究证明:金樱子煎煮液针对于金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌及流感病毒有着较强的抑菌作用或抗病毒作用;金樱子果实是有极大开发利用价值的第三代野生水果，既是一种良好的天然绿色食品，同时也可作为保健食品的基料，具有很大的开发价值。总之，金樱子具有很大的潜在价值，这还需要我们不断的深入研究，相信通过对金樱子进一步的研究，它将会发挥更大的作用。

超声提取的方法与其他实验方法相比，具有缩短实验提取时间、降低提取温度、提高实验提取效率、便于产品的纯化、对提取物的结构和理化性质无影响等优点，因此，本研究选取超声法提取金樱子。选择甲醇、丙酮、60%乙醇作为提取溶剂的原因，是因为实验室内部经过长期对抗病毒药物的筛选，发现这几种溶剂提取物抗病毒效果普遍较好。

实验研究表明，金樱子60%乙醇超声提取物抗病毒效果较好，乙醇作为一种提取溶剂，可将中药的大学部分成分(如苷类、多糖、鞣质、有机酸盐、蛋白质、酶和少量挥发油)不同程度的提取出来，且极性比甲醇、丙酮大。但其抗病毒物质基础尚不明确，应对其进一步研究。