角蛋白酶及其应用研究进展

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(发酵工程教育部重点实验室,工业发酵湖北省协同创新中心,工业微生物湖北省重点实验室,湖北工业大学,湖北武汉 430068)

角蛋白是一种硬质不溶性蛋白,由于其分子间富含二硫键以及疏水氨基酸,使其化学结构稳定,难以被降解利用。目前工业降解角蛋白的手段主要有高温高压水解法、酸碱水解法和传统酶解法,但这些方法都存在着高耗能、高污染甚至破坏氨基酸结构等问题[1]。而角蛋白酶能够专一性的降解角蛋白,不仅绿色环保,且不会破坏氨基酸天然结构,是一种理想的工业降解角蛋白废弃物的方式,并且角蛋白酶作为一种多功能酶,在食品、药品、清洁及皮毛加工等领域都有着广泛的应用。角蛋白酶的微生物来源广泛,导致许多角蛋白酶的性质各异,选择合适的角蛋白酶用于工业生产意义重大。本文综述了角蛋白酶来源、分类及性质、基因工程研究、作用机制及应用等研究进展,以期为今后的角蛋白酶生产应用提供参考。

1 角蛋白酶的来源、分类及性质

角蛋白酶是一种底物非常广的蛋白酶,能够降解多种可溶性及不可溶性蛋白质,如胶原蛋白、纤维蛋白、牛乳清蛋白、血红蛋白、酪蛋白等,最特别的就是它能够降解天然的角蛋白,使其变成可溶的氨基酸和多肽,并且作用条件温和[2]，相比于其他传统的蛋白酶有着明显优势[3]。角蛋白酶的发现,让人们找到了一种理想的,将角蛋白废弃物变废为宝的新途径。

1.1 角蛋白酶的来源

目前发现的角蛋白酶多来源于细菌,如Baclicus,Chryseobacterium,Stenotrophomonas,Caldicoprobacter,Vibrio和Pseudomonas等[4-9]。 其中芽孢杆菌属占主导地位,同时研究也最为深入。而部分放线菌也能够产角蛋白酶,主要为链霉菌属[10],如Streptomycesgulbargensis,Streptomycesfradiae,Streptomycesalbidoflavus等。真菌中有着大量的产角蛋白酶群体,其典型代表就是人体表的腐生真菌,包括引起甲真菌病的Scopulariopsisbrevicaulis[11]和引起皮肤真菌感染的Trichophytonmentagrophytes,Candidaalbicans,Microsporumcanis[11-15]等。除此之外,Kaul等[16]从100只鸟的羽毛中分离出了14种产角蛋白酶的真菌,分别属于10个不同的属:Chrysoporium,Malbranchea,Chaetomium,Sepedonium,Microascus,Scopulariopsis,Curvularia,Fusarium,Aspergillus,Penicillium,该发现在很大程度上扩大了角蛋白酶的研究范围。

以上微生物可以在养殖场以及屠宰场附近的土壤中或者动物的表皮、毛发上采集到,并使用粉状角蛋白作为培养基中的唯一碳氮源,能够筛选产角蛋白酶的微生物,并挑选水解圈与菌落直径比值较大的菌落进行发酵测试,获得其中高产角蛋白酶的菌株。蒋彪等[17]通过这种筛选手段获得了一株高产角蛋白酶的菌株Bacillussp。

1.2 角蛋白酶的分类

按照蛋白酶活性中心分类[18],角蛋白酶可分为三类,分别为:丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶。其中丝氨酸蛋白酶类的角蛋白酶数量最多,应用也最广,主要产自细菌,蛋白多序列比对发现这些微生物丝氨酸蛋白酶在多个区域高度保守,三联催化体Asp、His、Ser分别存在这些保守区域中,对于角蛋白的水解起到重要作用。金属蛋白酶类的角蛋白酶在细菌、放线菌和真菌中都有报道,其活性中心含有Zn2+等二价金属,对于其催化功能具有重要作用。而一些角蛋白酶同时属于丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶,同时拥有以上两类酶的性质。天冬氨酸蛋白酶类的角蛋白酶目前只在人体腐生真菌Candidaalbicans中有发现,活性中心含天冬氨酸,这种蛋白酶是Candidaalbicans感染人体皮肤的作用因子[13-14]。

1.3 角蛋白酶的理化性质

角蛋白酶是微生物经环境诱导后分泌的胞外酶,通过降解天然的蛋白底物为自身生长提供碳氮源。由于这些微生物生长环境以及种属不同,其分泌的角蛋白酶在各种性质上也会有差异,如表1。

表1 角蛋白酶的理化性质Table 1 The properties of keratinases

1.3.1 分子量 目前发现角蛋白酶的分子量从18～240 kDa都有发现,但大多都在30～60 kDa左右,其中芽孢杆菌属分泌的枯草杆菌蛋白酶之间具有高度的同源性,在许多性质上都非常相似,所以同属这个大家族的角蛋白酶的分子量也接近,均在30 kDa左右[19-21],而有些分子量高达几百kDa的角蛋白酶可能是复合酶[22]。

1.3.2 最适pH和温度 多数角蛋白酶最适pH基本都大于等于7,为中性或者碱性蛋白酶,而一些人体腐生真菌产的角蛋白酶在酸性条件下有最佳酶活[12-14],这可能与人体的皮肤环境为弱酸性有关;大部分角蛋白酶最适温度在40～60 ℃范围内,而一些极端高温条件下生长的微生物,其分泌角蛋白酶能表现出极佳的热稳定性(70 ℃以上)[7,23-24],有着相当高的工业应用价值。

1.3.3 底物特异性 角蛋白酶对于多种天然蛋白底物及人工蛋白底物有着不同的降解作用,大量可溶蛋白均能被角蛋白酶降解,如牛乳清蛋白、蛋清蛋白、酪蛋白、血红蛋白以及经过改造的氮角蛋白等,而在底物为不溶性蛋白时,如:羽毛、羊毛、人发、角质层、胶原蛋白,由于其特异性存在差异,多数细菌与放线菌来源的角蛋白酶对动物毛发有着较强的降解作用,而一些人体腐生真菌主要降解底物为人角质层和指甲,几乎不能降解动物毛发,这可能是长时间的环境选择进化决定的[12-14]。

1.3.4 影响其性质的一些化学环境 Ca2+、Mg2+对多数角蛋白酶有着很好的激活作用,Ni2+、Hg2+、Cd2+则对多数角蛋白酶有着抑制作用。DTT(二硫苏糖醇)、β-Me(β-巯基乙醇)等还原剂能够协助角蛋白酶加速角蛋白的降解,但是含二硫键的角蛋白酶在以其他含少量或者不含二硫键的蛋白质为底物时,需要注意其解酶二硫键的负效应。

1.4 角蛋白酶氨基酸序列分子进化树

从NCBI下载了17个被报道过有角蛋白酶活性的蛋白序列,并使用MAGE6软件下的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统发育树。从图1可以看出这些角蛋白酶虽然分为两个簇,但是Microsporumcanis和Pseudomonasaeruginosa来源的角蛋白酶和该簇里的其他角蛋白酶基因有着十分疏远的亲缘关系,所以在整体上看来存在三个簇,并且这三个簇在一定程度上符合角蛋白酶按照活性中心分类的结果。芽孢杆菌属来源的角蛋白酶都集中在一个簇里面,但是Bacilluscereus和Bacillusthuringiensis来源的角蛋白酶与其他芽孢杆菌来源的角蛋白酶却有着明显的进化差异,这点在多序列对比时也有发现(多序列对比结果未给出),所以在筛选一个未知的芽孢杆菌角蛋白酶基因时,根据这两个分支,至少需要设计两套兼并引物,才能准确的锁定这些角蛋白酶基因。

图1 部分角蛋白酶氨基酸序列分子系统树Fig.1 Molecular phylogenetic tree of partial keratinase amino acid sequences注:数字为置信度,仅显示70%以上的置信度。

2 角蛋白酶的生产

一般条件下野生型产角蛋白酶菌株的酶产量都很低,即便通过优化培养基的手段,产量提升也不是很明显,而且这些菌株对于生长环境的要求也比较高。蒋彪等[25]通过响应面法优化培养基,仅使野生菌株Bacillussp产酶量提升了20.74%,并且由于天然蛋白酶热稳定性较差以及野生菌株分泌的杂蛋白多而难以纯化,直接导致了野生型菌株发酵生产的经济效益低的结果。目前这些不足均可利用基因工程技术解决,通过对角蛋白酶基因的改造,能提高角蛋白酶稳定性和产量,携带融合标签的角蛋白酶也更利于纯化,此外底物特异性的改造,使得角蛋白酶的应用更加具有针对性。“利用基因工程酵母生产角蛋白酶的中试研究”曾被列为“十五”国家科技攻关项目,由此可见角蛋白酶基因工程研究的重要性。

2.1 选择合适的表达宿主

有活性的蛋白酶的表达往往会影响宿主的生长,胞内表达影响更大。比如大肠杆菌作为基因工程中最常用的表达宿主,在进行蛋白酶胞内表达时,往往会出现大肠杆菌生长被抑制甚至菌体死亡或者包涵体表达等情况,针对这一情况,可以使用含有N端信号肽的质粒,使角蛋白酶定位到大肠杆菌周质空间,降低毒性。刘伯宏等[26]利用pET-22b(+)将来源于BacilluslicheniformisBBE11-1的角蛋白酶基因在大肠杆菌中成功表达,并在胞外检测到酶活,证实了利用大肠杆菌分泌表达角蛋白酶的可行性。毕赤酵母和枯草芽孢杆菌在分泌表达角蛋白酶时优势更加突出,毕赤酵母拥有完善的分泌表达体系，能够使异源蛋白正确折叠,能完全分泌至胞外,而且酵母表达系统的糖基化作用还能够提高酶的工作稳定性[27],但过度的糖基化可能会导致酶特异性的改变;枯草芽孢杆菌也具有较为完整的蛋白质折叠分泌机制,在表达来源于芽孢杆菌属的角蛋白酶基因时基本不存在密码子偏好性问题,这使得芽孢杆菌属来源的角蛋白酶能在枯草芽孢杆菌宿主中实现超表达[28]。

总而言之,在表达一个角蛋白酶基因时,针对宿主对外源蛋白的排斥性以及宿主的密码子偏好问题,可以考虑选择与基因来源菌亲缘关系更加接近的宿主来表达这些角蛋白酶。马怡茗等[29]利用大肠杆菌表达来源于StreptomycesalbidoflavusFea-10的角蛋白酶失败后,使用同属的StreptomycespactumACT12却能成功表达。那么我们可以进一步想到角蛋白酶产生菌自身未尝不是一个极佳的表达宿主,一个BacillusamyloliquefaciensK11来源的角蛋白酶基因先后在BacillussubtilisSCK6和自身中转化表达,在后者中发现了更高的胞外酶活性[30]。

现在更多的表达宿主被人们发现,人们也在尝试使用这些新型宿主用于角蛋白酶的表达。如Huang M等[31]首次使用昆中细胞Spodopterafrugiperda(Sf9),成功表达了来自BacilluslicheniformisPWD-1的角蛋白酶基因,为人们提供了一个新的表达思路。

2.2 角蛋白酶基因的改造

提高表达量的改造:主要是密码子优化的手段,密码子偏好性问题是蛋白异源表达时的一个严重障碍,往往导致目标蛋白产量低,甚至在连续稀有密码子存在的情况下蛋白不表达,那么根据宿主的密码子偏好性进行密码子优化,就成为了一个提高角蛋白酶异源表达效率的重要手段,尤其是对于连续的稀有密码子的优化,可以明显提升表达量[32]。其次前肽的切割对蛋白的分泌表达有着重要影响,通过优化切割位点,可以加快蛋白的成熟与分泌[33]。

提高热稳定性的改造:在认识到蛋白质结构与功能的关系后,蛋白酶的定向进化越来越被人们所重视,相比非理性突变,准确率高,操作量更小,常用于蛋白酶稳定性和底物特异性的改造。在已知或者通过同源建模模拟得到角蛋白酶三维结构后,利用蛋白热力学分析软件分析相关氨基酸残基位点,在活性中心外的区域,通过引入氢键、离子键、二硫键以及脯氨酸替换的方式,得到热稳定性更高的角蛋白酶。但是氢键[34]和离子键[35]这些弱相互作用力的引入,对于改造酶的效果往往与环境有很大的关系,并受到多种条件的影响,并且对于其原理也没有完全弄清,需谨慎使用。而二硫键的引入和脯氨酸替换则是较为理想简单的途径,二硫键的引入能够提高角蛋白酶的解链温度[36];脯氨酸替换则是利用空间阻位较大的脯氨酸(还有酪氨酸等)取代空间阻位较小氨基酸,来限制蛋白酶局部运动,维持构象,提高角蛋白酶热稳定性[30,37],也有报道称这样可以降低酶的自溶[38]。

底物特异性的改造:底物特异性改造对于角蛋白酶的应用十分重要,角蛋白酶底物广在一般情况下是优点,但在有些情况下,也是不足,比如在皮革脱毛的过程中,过高的胶原蛋白酶活性就会使其应用价值大大降低,而底物特异性的改造就能解决这一难题。目前在枯草杆菌蛋白酶中已有一定的进展,人们发现枯草杆菌蛋白酶中底物结合区的空间阻位和静电分布与其底物特异性密切相关,其中S1,S4底物结合区起到主要作用,所以针对S1,S4底物结合区的改造研究成为重点,主要是使用不同疏水性或不同侧链大小的氨基酸替换关键位点[39]。 Estell等[40]将S1底物结合区最底部的Gly166用12种不同的疏水氨基酸取代,发现S1区疏水性的增加更利于酶与疏水性P1底物的结合。方真等[41]发现S1口袋中位于中间位置的Tyr215对于角蛋白酶的催化功能有着重要影响,该位点的疏水性增加,对应的角蛋白酶活力呈现先增加后降低的趋势,侧链空间大小的增加(口袋的缩小)则导致其对于P1位氨基酸残基较小的底物酶活增加;刘伯宏等[37]通过在S4底物结合区通过增大(M134A)和缩小(I106F)结合口袋大小,得到了对于天青角蛋白活性提升的正突变子,但是两者的组合突变不仅没有得到叠加效果,反而失去了对于天青角蛋白的活性。不同构象的底物口袋对应着不同底物,所以改造的前提是了解不同底物的结构特点,然后在一个合理的范围内改造。

目前需要更多关于热稳定性和底物特异性改造的研究,建立一个突变库,包含提高稳定性以及改变底物特异性的位点,使角蛋白酶的改造变得更加方便快捷准确,让其应用价值最大化。

表2 角蛋白酶基因的改造Table 2 The gene modification of keratinase

3 角蛋白酶的应用及其作用机制

角蛋白的降解过程可分为两步,二硫键的断裂和肽链的水解,这两个步骤相辅相成,互相促进。二硫键的打开,肽链变得松散,其上的酶切位点暴露,有利于角蛋白酶快速降解角蛋白。

3.1 二硫键的还原

角蛋白酶负责水解肽链,却无法对二硫键起作用,所以在微生物利用角蛋白的过程中,其分泌的能够还原二硫化物的辅助因子(如二硫化物还原酶)起着关键性的作用。当微生物作用于羽毛过程中，羽毛降解的同时伴随着培养基中亚硫酸盐的积累(二硫键先经过还原断裂，其后再经过一系列的氧化还原反应)[42]；以及二硫键还原酶和角蛋白酶混合处理角蛋白时，水解速度是单一角蛋白酶处理的50倍[6],这两个现象的发现充分证实了辅助还原因子在降解角蛋白时的重要性。

3.2 疏水氨基酸的切割

角蛋白酶能够特异性降解角蛋白,而一般蛋白酶却没有此能力。经研究发现,是由于角蛋白表面富含疏水氨基酸残基,一般蛋白酶几乎“无从下手”,而角蛋白酶却有着极强的疏水氨基酸残基的切割能力,对于富含疏水氨基酸残基的蛋白质,有着很好的亲和力。以合成短肽作为底物,有研究发现角蛋白酶对于疏水氨基酸含量高的肽链的亲和力明显高于疏水氨基酸含量低的,并能高效切割 P1(对应S1底物口袋)位点为芳香族氨基酸和疏水氨基酸的氨基酸残基[43-44],导致外部疏水区的瓦解,内部的水解位点暴露,角蛋白降解加快,在还原因子的作用下完全降解。而用角蛋白酶预处理羽毛后,无角蛋白酶活性的蛋白酶能够在合适的还原剂下继续降解角蛋白[3],也说明了角蛋白酶切割疏水氨基酸的特异能力是其区别于其他蛋白酶的重要特征。

4 角蛋白酶的应用

4.1 饲料中的应用

角蛋白酶可以将羽毛、羊毛等角蛋白废弃物加工降解成动物可消化吸收的多肽和氨基酸,绿色安全且更利于动物消化利用[45]。饲料中蛋白成分复杂,由于其底物广,角蛋白酶可以代替多数的蛋白酶被添加到饲料中;且角蛋白酶还有降解饲料中朊病毒的能力。

4.2 药物辅助剂

灰指甲的感染部位在指甲下面,目前很多药物由于渗透性低导致效果并不理想,而添加角蛋白酶作为渗透剂可增强药物效果[46]。在药品中添加角蛋白酶可用于皮肤角质增生引起的鸡眼和老茧等皮肤问题[47]。同时角蛋白酶可以作为治疗痤疮药物添加剂[48]。产自人体腐生真菌的角蛋白酶会是较好的选择。

4.3 朊病毒的降解

具有致病能力的朊病毒具有高度的β-折叠结构,类似于羽毛角蛋白,结构顽固。角蛋白酶能够在温和条件下降解朊病毒对手术器械进行消毒[49],使器械免受损伤。

4.4 动物皮毛制造

皮革制造过程中传统脱毛处理污染严重[50],然而角蛋白酶的出现,将会解决脱毛过程中带来的化学污染问题。特别是一些无胶原蛋白酶活性的角蛋白酶,非常适用于皮革脱毛工艺[20]。

角蛋白酶能够优先水解角质层的作用,不仅能够改良了羊毛毡缩效果,还能防止其内部纤维的水解[51-52]。

4.5 去垢剂添加剂

角蛋白酶可以被添加到洗涤剂中,用来清除衣物上的血渍、食物残留以及袖口和领口的角质污渍[53];含有角蛋白酶的疏通剂则可以疏通由头发引起的浴室管道堵塞等。

4.6 食品行业中的应用

角蛋白中含有丰富的呈味氨基酸,可使用角蛋白酶降解角蛋白生产鲜味剂,安全节能,同时经过角蛋白酶处理后的水解液还可以作为提鲜剂加入到面包、罐头等食物中,来增强口感与营养。另外,角蛋白酶还可以用于肉制品嫩化、蚕丝脱胶以及燕窝脱毛[54]。

4.7 在其他方面的应用

利用角蛋白酶来处理医院废弃的胶片,完整地回收纤维素酯基地[55];可以用角蛋白酶处理废弃的角质来获得廉价的氮肥;还有研究发现角蛋白酶可来杀死南方根结线虫,具有生物农药的潜力[56]。总之,由于底物广,角蛋白酶可以应用在多个领域,并且其独有的角质降解能力,使其在蛋白酶中脱颖而出,今后将会成为人们在蛋白酶领域研究的焦点。

5 展望

角蛋白酶不仅可以绿色安全的处理日益增多的解蛋白废弃物，并且由于角蛋白酶底物广的特性，可以将其推广到我们生活中的每一处,从洗涤剂到药物,从动物饲料到人的营养品都将有角蛋白酶的踪迹,而如何高产角蛋白酶以及提高角蛋白酶的工作性能是这一切的关键。目前国内外有关角蛋白酶的研究依旧存在着一些问题,比如角蛋白酶活性测定仍没有统一的标准,导致多种角蛋白酶的性质毫无对比价值;国内的角蛋白酶生产依旧使用野生菌株发酵,难以获得纯度高、安全系数高的角蛋白酶;产品定位低,与国外已经商业化的角蛋白酶品牌(Bioresource International和Proteos Biotech早已推出多种针对不同用途的高档角蛋白酶产品)相比相差甚远;再者由于成本原因,利用角蛋白酶大规模绿色降解角蛋白的例子也鲜有耳闻,而多数是利用微生物降解,产品杂质多,质量差;而且目前应用较多的均是来源于芽孢杆菌属的角蛋白酶,对于真菌和放线菌来源的应用研究较为少见,很大程度上限制了角蛋白酶的开发。因此应该加快对各类角蛋白酶的生产研究和角蛋白酶解工艺的探索,并使用固定化酶等手段使角蛋白酶能够重复使用,DMA(二甲基乙酰胺Dimethylacetamide)[57]、NPC-PEG(硝基苯酚碳酸酯-聚乙二醇Nitrophenolcarbonate-Polyethylene Glycol)[58]等化学剂对于角蛋白酶的化学修饰作用能够提升酶的热稳定性,后期研究是否能够将这种化学修饰和固定化技术结合起来,节省成本的同时提升稳定性,这将是未来角蛋白酶化学修饰方面的另一研究方向。