薇甘菊颈盲蝽细胞色素P450 PmCYP4基因克隆及表达分析

张传光， 泽桑梓， 朱家颖， 季 梅， 刘 凌， 张乃明

1云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201； 2云南省林业科学院，云南 昆明650204； 3云南省林业有害生物防治检疫局，云南 昆明 650051； 4西南林业大学，云南 昆明 650224

薇甘菊MikaniamicranthaH. B. K.是世界上最具侵略性的杂草之一(范志伟等,2016; Mingetal.,2017)，也是唯一一种全国林业检疫有害植物(徐小伟等,2014)。物种在入侵过程中与入侵生境中其他物种相互竞争、协同适应，如入侵我国云南的薇甘菊挥发油内普遍存在β-cadinene、allo-aromadendrene、β-caryophyllene及5-(1,1-dimethylethyl)-2,3-1H-Inden-1-one 等多碳化合物(季梅等,2012; 孙盟等,2013)，而生长在原产地秘鲁的薇甘菊检测不到这些物质，说明入侵地薇甘菊的次生代谢物种类发生了改变，且含量也明显增加(Nietal.,2007)。此外，薇甘菊在入侵的过程中其体内的化学防御素——缩合单宁也显著高于本地物种(倪广艳等,2014)。

Yiran & Liu (2017)首次报道了一个专食薇甘菊的新种——薇甘菊颈盲蝽PachypeltismicranthusMu et Liu，是控制云南省瑞丽市薇甘菊的一种本土天敌昆虫。研究发现，被薇甘菊颈盲蝽取食后，薇甘菊叶片中的防御性酶POD和PAL的活性下降，PPO活性提高(季梅等,2014； 李胜等,2018)，说明在被颈盲蝽取食后薇甘菊很快做出了防御反应。植物次生物质能对昆虫产生不利影响，甚至产生毒杀作用，而昆虫则通过对植物次生物质忌避取食、解毒代谢等多种机制，对寄主植物产生适应性(陈澄宇等,2015)。其中，细胞色素P450 (cytochrome P450, CYP)作为最古老和最庞大的超基因家族，其介导的多功能氧化酶(microsomal mixed function oxidases，MFO)是昆虫中涉及抗性的3大主要代谢解毒酶类之一，对多样的外源化合物和内源化合物的氧化代谢起作用(Hrycay & Bandiera,2009; Omura,1999)，特别是CYP4家族基因在昆虫对植物次生物质的解毒代谢及与寄主植物相互作用中发挥了重要作用(吴益东等,1997; Dingetal.,2013; Edietal.,2014; Feyereisen,1999)。

Feyereisenetal. (1989)克隆了第一个昆虫CYP基因，此后，昆虫CYPs逐渐成为研究热点(艾均文等,2015)。对于微甘菊颈盲蝽而言，如何应对宿主植物的化学防御，其体内存在何种代谢解毒酶，相关基因在不同部位的表达量如何，都未有相关的报道。本文旨在克隆薇甘菊颈盲蝽CYP4基因，研究其在不同部位的表达情况，为深入研究其在薇甘菊颈盲蝽与薇甘菊互作中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫 薇甘菊颈盲蝽采自云南省瑞丽市。

1.1.2 实验试剂及主要仪器 Trizol、SMARTTMRACE cDNA amplification kit (Clontech)、DNA Marker DL2000均购自宝生物工程(大连)有限公司，PrimeScripttmRT reagent Kit with gDNA Eraser购自Takara公司。

高速冷冻离心机(5804R型，德国Eppendorf公司)，PCR仪(Veriti96型，美国Applied Biosystems公司)，荧光定量PCR仪(Rotor Gene-Q型，德国QIAGEN公司)，凝胶成像仪(GBOX iChemi型，英国Syngene公司)，超微量紫外分光光度计(NanoDrop 2000，美国Thermo公司)。

1.1.3 培养基 LB培养基：酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl分别为5、10、10 g·L-1，用NaOH调节pH为7；加入15 g·L-1琼脂为LB固体培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集方法 将捕捉到的雌、雄活体切分为触角、残体、翅膀、足4个部分，迅速保存至液氮中带回实验室，每部分3个重复，每个重复100头。

1.2.2 总RNA的提取及CYP基因的克隆 参照Trizol试剂说明书，以样品研磨提取总RNA，提取到的总RNA，采用紫外分光光度计检测其质量，储存在-80 ℃冰箱备用。

以提取的总RNA为模板，用SMARTTMRACE cDNA amplification kit (Clontech)反转录试剂盒合成cDNA第一链。根据实验室前期对薇甘菊颈盲蝽cDNA文库测序获得的CYP片段序列，设计5′RACE和3′RACE特异性引物(5′-GGCAAAGGTCTGCTGACAAGTA-3′和5′-TGAATGGTACGTAGGCAA

ACGG-3′)，以反转录合成的cDNA为模板，参照RACE试剂盒说明书，PCR扩增该基因的3′端和5′端序列。PCR反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。利用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，TA克隆接入pGEM®-T-easy载体(Promega)，蓝白斑筛选，挑取阳性克隆送至昆明硕擎生物科技有限公司进行测序。

1.2.3 序列分析 用ORFfinder (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)将CYP的核苷酸序列翻译成氨基酸序列；用ProtParam (https:∥web.expasy.org/protparam/)对蛋白进行基本进化性质分析；用SignalP 4.1 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)对信号肽进行预测；用ClustalX 1.83进行多序列比对分析进化树(Thompsonetal.,1997)，MEGA 7.0软件构建NJ (neighbor-joining)分子系统进化树(Kumaretal.,2016)。

1.2.4 荧光定量PCR 用Trizol试剂提取各样品总RNA，将各样品总RNA定量至1 μg，用PrimeScripttmRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒对提取的各样品总RNA先进行基因组DNA的去除，定量后再反转录成cDNA模板。根据实验前期克隆获得的CYP cDNA序列，设计特异性引物(5′-CGTTTTTCTCCGAGCGTTC-3′和5′-TTGAACTTCGA

CGGGTTGG-3′)，对该基因在薇甘菊颈盲蝽不同性别、不同部位中的表达量进行荧光定量PCR分析。以18S RNA为内参基因(5′-TTTCAAATGTCTGCCTTATC-3′和5′-TGTGGTAGCCGTTTCTCA-3′)，每个样品重复3次。PCR反应条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火20 s，39个循环。荧光定量PCR结果采用E-∆∆CT法进行计算，根据该方法把表达量最低的样品表达量值定义为1(Livak & Schmittgen,2001)。最后，用Excel对数据进行整理、IBM SPSS Statistics进行方差分析和S-N-K多重比较、Origin Pro 2016进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 PmCYP4生物信息学分析

2.1.1PmCYP4编码氨基酸理化性质PmCYP4 cDNA全长1713 bp，ORF为1500 bp，编码500个氨基酸，5′端非编码区27 bp，3′端非编码区183 bp，无信号肽(图1)。编码氨基酸的基本理化性质见表1。

图1 PmCYP4基因的开放阅读框和推测的氨基酸序列Fig.1 ORF and the deduced amino acid sequences of PmCYP4

指标Index预测结果 Predicted outcome分子式 Molecular formulaC2611H4061N673O739S23分子质量 Molecular weight/(ku)57.44氨基酸数 Number of amino acids500等电点 Isoelectric point6.93负电荷残基 Asp+Glu63正电荷残基 Arg+Lys62平均亲水系数Average hydrophilicity-0.279不稳定系数 Instability index28.84脂肪系数 Aliphatic index84.02

2.1.2PmCYP4基因序列分析PmCYP4编码的氨基酸序列中的2个保守区域见图1和图2(下划线部分)：(1)CYP4家族成员保守区EVDTFMFEGHDTT(周夏,2015);(2)FXXGXXXCXG/A区域，为红素结合环，C是保守的半胱氨酸，X代表任意密码子，其为血红素铁第5个配体，也是在450 nm处与CO结合产生吸收峰特征性光谱的原因(邱星辉和冷欣夫,1998; 郑明奇等,2001)。

不同物种、不同来源的CYP基因均有高度的序列同源性，序列比对发现，PmCYP4与地中海实蝇Ceratitiscapitata、家蝇Muscadomestica、辣椒实蝇Bactroceralatifrons、铜绿蝇LuciliacuprinaCYP4的氨基酸同源性分别为41%、42%、43%、45%(图2)。系统进化树显示，PmCYP4与温带臭虫CimexlectulariusCPY4基因编码的蛋白同源性处于同一分支上，进化关系最近(图3) 。

图2 PmCYP4与其他昆虫CYP多序列比对Fig.2 Multiple alignment of PmCYP4 and other insects CRY：砂白蚁,PNF27066.1;ZOO：内华达古白蚁,KDR12230.1;NIL：褐飞虱,AIW79997.1;CAM：佛罗里达弓背蚁，XP_025266601.1;PAC：薇甘菊颈盲蝽。下划线部分为PmCYP4编码的氨基酸序列中的2个保守区域。黑色和灰色阴影分别表示保守性极高和较高的残基位点。 CRY： Cryptotermes secundus, PNF27066.1; ZOO： Zootermopsis nevadensis, KDR12230.1; NIL： Nilaparvata lugens, AIW79997.1;CAM： Camponotus floridanu, XP_025266601.1; PAC： Pachypeltis micranthus. The underlined parts were two conserved domains of the amino acid sequences of PmCYP4. Residues identical or similar are highlighted in black and grey respectively.

图3 PmCYP4基因系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of PmCYP4CER:地中海实蝇,XP_004521346.1;BAC:辣椒实蝇,XP 018799661.1;MUS:家蝇,XP_005186030.1;LUC:铜绿蝇, XP_023297259.1;FOP:阿里山潜蝇茧蜂,XP_011300548.1;NEO:红头松叶蜂,XP_015512314.1;ZOO:内华达古白蚁,XP_021934792.1;CRY:砂白蚁,XP_023705844.1;ONT:嗡蜣螂,XP_022906724.1;HAL:茶翅蝽,XP_014284338.1;CIM:温带臭虫,XP_014249034.1。CER: Ceratitis capitata, XP_004521346.1; BAC: Bactrocera latifrons, XP 018799661.1; MUS: Musca domestica, XP_005186030.1; LUC: Lucilia cuprina, XP_023297259.1; FOP: Fopius arisanus, XP_011300548.1; NEO: Neodiprion lecontei, XP_015512314.1; ZOO: Zootermopsis nevadensis, XP_021934792.1; CRY: Cryptotermes secundus, XP_023705844.1; ONT: Onthophagus taurus, XP_022906724.1;HAL: Halyomorpha halys, XP_014284338.1; CIM: Cimex lectularius, XP_014249034.1.

2.2 mCYP4基因荧光定量PCR分析

PmCYP4在薇甘菊颈盲蝽雌、雄虫中的表达量都是足中最高，显著高于翅膀、触角、残体。雌虫残体中表达量最低，触角、翅膀、足中的表达量分别是其1.15、1.88和11.90倍，残体、触角和翅膀中的表达量无显著差异；雄虫触角表达量最低，残体、翅膀、足中的表达分别是其1.02、6.07和16.32倍，且翅膀中的表达量显著高于残体和触角，而残体和触角中的表达量无显著差异；雌虫翅膀、残体及触角与雄虫相应组织中的表达量无显著差异，但雄虫翅膀中的表达量显著高于雌虫翅膀，是其2.37倍(图4)。

图4 PmCYP4基因在薇甘菊颈盲蝽不同部位中的表达量Fig.4 Relative expression levels of PmCYP4 gene in different parts of P. micranthusFA:雌虫触角；FB:雌虫残体；FL:雌虫足；FW:雌虫翅膀；MA:雄虫触角；MB:雄虫残体； ML:雄虫足；MW:雄虫翅膀。不同字母表示在 5%水平上差异显著。FA: Antenna of female; FB: Residual body of female; FL: Leg of female; FW: Wing of female; MA: Antenna of male; MB: Residual body of male; ML: Leg of male; MW: Wing of male. Different letters mean significant differences at 5% level．

3 讨论

CYP基因家族包括36个基因族(李显春等,1999; 张宇宏等,2015)，昆虫中已鉴定的CYP分属于CYP4、CYP6、CYP9、CYP12、CYP18、CYP28等27个家族，除CYP4家族外全是昆虫特异的家族(Feyereisen,1999)。通过序列比对，此次克隆到的薇甘菊颈盲蝽PmCYP4基因与CYP4家族基因编码的蛋白同源性最高,且存在2个保守区域。Blast结果表明，薇甘菊颈盲蝽CYP基因与其他昆虫的CYP4家族的同源性都大于40%，所以PmCYP4应属于CYP4家族。

CYP4基因起源于1000多万年前，早于脊椎动物和无脊椎动物分化(Bradfieldetal.,1991)，其功能包括促进多种激素及甾醇的生物合成和降解，调节昆虫发育和形态改变(杨帆和王进军,2008)，代谢植物有毒物质、多种杀虫剂,诱导诱变剂等(Gu & Knipple,2013)。薇甘菊颈盲蝽的CYP4家族基因的主要作用可能是调节内源性物质和代谢食物中的有毒物质，PmCYP4应主要分布于中肠、脂肪体和马氏管中，表达部位及量应无性别差别,在残体中有几乎同水平的表达量，但表达量很低。因此，PmCYP4基因可能参与了食物源有毒化合物的代谢，但不是其主要功能。CYP4基因也参与了信息素的失活(Lazardetal.,1990; Maïbèchecoisneetal.,2005)。在繁殖期，薇甘菊颈盲蝽雌虫通过气味分子来引诱雄虫交尾(王大伟等,2014; 泽桑梓等,2017)，而PmCYP4基因在雌、雄虫触角中的表达量很低且无差异，所以PmCYP4基因没有参与性信息素的失活，但可能参与了环境信息素的失活。

本研究发现，PmCYP4在雌、雄虫的足中表达量显著大于其他部位，雄虫翅膀中的表达量显著大于雌虫，GO数据库对此基因的功能注释之一是作为配对供体，结合或减少氧分子来增加氧化还原酶活性(GO:0016705)。前期对薇甘菊颈盲蝽的生物特性研究中发现，该虫的爬行能力较强，飞翔能力较弱，且雄虫飞翔能力远强于雌虫，据此推测，PmCYP4的主要功能可能是编码与运动相关的酶。