萃取浓缩沼液对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌抑制效果的影响研究

刘继红， 尹 芳， 王昌梅， 赵兴玲， 吴 凯， 柳 静， 杨 红， 刘士清， 张无敌

(云南师范大学， 云南 昆明 650500)

三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)是一种人参属双子叶被子植物[1]，喜生长于温暖、避光、阴湿的环境[2,3]。三七主要成分与人参相似，包括氨基酸、糖类、皂苷、挥发油、黄铜、微量元素等[4]，从而决定三七具有广泛的药用价值[5]，是一种驰名中外的名贵药材。但目前因三七独特的生长环境和栽培方式，其复种年限增长且无明显效果，再加上三七农的不合理施肥和用药。导致栽培三七的土壤中各种土传病菌繁殖和流行，尤其是三七根腐病，造成三七连作障碍加剧，严重影响了三七植株的正常生长[6,7]。经研究鉴定显示，尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)就是导致三七根腐病的主要病原菌[8]。

沼气是有机物质秸秆、杂草、人畜粪便、垃圾、污泥等，在厌氧条件下，多种微生物对其进行分解厌氧代谢的产物。沼液中含有丰富的营养物质、矿物质、水解酶、B族维生素、氨基酸、植物激素、抗生素和腐殖酸等，是一种很好的有机液肥，和生物农药[9-10]。另外许多研究显示，沼液对多种植物病原菌都有很好的抑制效果。但目前还未出现将沼液应用到防治三七根腐病病原菌的相关案例。

目前防治三七根腐病的措施有很多，包括农业防治、生物防治、化学防治等[7]，虽然这些措施在防治三七根腐病上具有各自的优势，但是依然不具有持久、有效的防治效果。鉴于目前还没有用沼液来防治三七根腐病病原菌的相关研究，为了探究沼液中活性物质对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌的抑制效果，本实验采用6种不同极性的有机溶剂(乙酸乙酯、苯、乙醚、甲苯、环己烷、石油醚)对沼液去除80%水分以后的浓缩液进行萃取再浓缩，旨在于探究出能否萃取浓缩出对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌有抑制效果的物质，从而增强沼液抵抗尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌的能力。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试病原菌

实验所用尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌由云南师范大学能环学院农村能源重点实验室(该室分离提纯并鉴定的菌株)所提供。

1.1.2 培养基

实验室采用常规的PDA培养基[11]。采用马铃薯为培养基，配方为：马铃薯200 g(去皮切成1 cm 左右的正方体小块后煮30 min，过滤取清液用)，葡萄糖25 g，琼脂13 g，加水至1000 mL，不调节pH值。

1.1.3 药品

葡萄糖、琼脂条、乙醇、乙酸乙酯、苯、乙醚、甲苯、环己烷、石油醚

1.1.4 仪器

RE-52型旋转蒸发仪、SHZ-D(III)循环水式真空泵、101型鼓风干燥箱、SW-CJ-1D型超净工作台、GH-400BC隔水式恒温培养箱、GMSX-280手提式高压蒸汽灭菌锅、电磁炉、烧杯、玻璃棒、纱布、培养皿、无菌打孔器、镊子、接种环。

1.1.5 供试沼液

取自玉溪一沼气工程的猪粪发酵沼液

1.2 方法

1.2.1 沼液的处理方法

用双层纱布过滤，将大颗粒悬浮物滤去，待做浓缩实验

1.2.2 试验方法

(1)先在T=60℃，P=0.075-0.08 MPa使沼液去掉80%的水分[12]；

(2)待浓缩液冷却至室温后，用浓缩液和6种有机溶剂(乙酸乙酯、苯、乙醚、甲苯、环己烷、石油醚)1∶2的比例进行单独萃取；

(3)萃取分液后，用T≤60℃，P≤0.07 MPa来回收有机溶剂；

(4)待萃取物冷却后，用来做抑菌试验；

(5)抑菌试验：将供试菌种接种于PDA平板培养基上培养至长满整个平板，放置备用。接着将萃取物、萃取后剩余物、有机溶剂、浓缩液、原沼液、无菌水分别依次取500 uL于平板表面涂布均匀，用打孔粘贴法进行抑制尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌的实验。取布满供试尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌的PDA培养基平板，用无菌打孔器(φ=9 mm)对平板进行菌斑打孔，接着用镊子小心地将菌种块移入不同抑菌液处理的平板上，菌丝一面朝上，每个培养皿中放入3小块菌种，并呈三角形放于平板中央，加盖并标记，放于30℃隔水式恒温培养箱中培养，每培养24 h观察测量菌斑的直径[13,14]。

(6)待培养24 h以后，用十字交叉法测量菌块生长的大小。之后每24 h对菌块进行一次测量，一共测量4 d的数据[13,14]。

1.2.3 数据处理方法

抑制菌丝生长率计算采用生长速率法[13-14]。

抑制数(cm)=对照平板培养基上菌落直径-处理平板培养基上

菌落直径

2 结果与分析

2.1 沼液萃取成分对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌的抑制效果对比研究

不同极性的6种有机萃取剂对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌具有不一样的抑菌效果，抑制效果如图1、图2所示：

图1 不同有机溶剂对尖孢镰刀菌的抑制效果

图2 不同有机溶剂对腐皮镰孢菌的抑制效果

从图1来看，不同有机溶剂对尖孢镰刀菌具有不同的抑制效果。随着培养时间的延长，环己烷的抑制效果呈现先下降再上升的趋势，第1天为抑制效果的峰值；其中，甲苯、乙酸乙酯、苯、石油醚对尖孢镰刀菌的抑制效果呈现先上升后下降的趋势。在培养第2天出现抑制效果的峰值；其中甲苯对尖孢镰刀菌具有较强的抑制效果，高达51%。

从图2可看出，甲苯、乙酸乙酯、环己烷、乙醚4种有机溶剂对腐皮镰孢菌的抑制效果随培养时间的增加而下降；苯和石油醚对腐皮镰孢菌的抑制效果随培养时间的增长，呈现先上升后下降的趋势并在第3天达到抑菌峰值；其中甲苯的抑制效果最强，高达31%。

2.2 不同有机溶剂萃取成分对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌的抑制效果

不同有机溶剂萃取得到的物质对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌抑菌效果的影响如图1和图2所示。

由图3和图4可看出，各有机溶剂萃取物都对两种病原菌具有较好的抑制效果，且随着培养时间的增长，萃取物的抑菌效果也逐渐增强，但浓缩液和原沼液对两种病菌的抑制效果随着培养时间的增加出现先上升后下降的趋势。从两个图可看出，乙醚萃取得到的萃取物抑制效果最佳，最高可达71%，原沼液和无菌水对照的抑菌效果相对较差。从而也说明沼液经有机溶剂萃取浓缩后，抑菌效果得到提高，也说明有机溶剂能提取出抑菌活性物质加强其抑菌能力。

图3 不同有机萃取剂萃取物对尖孢镰刀菌的抑菌效果

图4 不同有机萃取剂萃取物对腐皮镰孢菌的抑菌效果

2.3 不同有机溶剂萃取后剩余物对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌的抑制效果

不同有机萃取剂萃取浓缩液后的剩余物对尖孢镰刀菌具有较弱的抑制效果，抑菌效果如图5所示。

由图5和图6可看出，随着培养时间的增加不同有机萃取剂萃取剩余液对尖孢镰刀菌的抑制效果均呈现出先上升后下降的趋势，在第4天时，所有萃取剩余物都失去对尖孢镰刀菌的抑制效果，抑菌率均下降为0%，各萃取剩余物均失去抑菌效果。

图5 不同萃取剂萃取剩余物对尖孢镰刀菌的抑制效果

图6 不同萃取剂萃取剩余物对腐皮镰孢菌的抑制效果

2.4 各处理之间的差异性分析

2.4.1 对沼液的不同处理对尖孢镰刀菌抑制效果的差异性分析

用DPS数据处理系统对实验数据进行单因素方差分析，可见表1。

表1 各处理间方差分析

从表1可看出，p<0.05各处理间存在明显差异(具有显著极差)。也说明沼液在萃取浓缩前后抑菌效果变化较大，其中乙醚萃取物的抑菌效果最强，达到71%。但是其余5种有机溶剂萃取物的抑菌效果都相差不大，都在70%左右。说明萃取浓缩可增大沼液中活性物质的浓度，增强沼液的抑菌能力。

表2 各处理间的多重比较分析

注：5%显著水平用小写字母标记；对于不同处理，字母标记相同的数据间不存在差异性，例如ab与ab，字母标记不同的数据间存在显著差异，例如a与bc，字母标记中含有重复字母的数据间不存在显著差异，例如a与ab。1%极显著水平用大写字母标记；对于不同处理，字母标记相同的数据间不存在差异性，例如A与A，字母标记不同的数据间差异达到极显著水平，例如A与B，字母标记中含有重复字母的数据间不存在极显著差异，例如A与AB。

由表2可以看出，萃取物和萃取剩余物、原沼液、浓缩液及无菌水对照之间的抑菌率存在极显著差异性。其中属乙酸乙酯萃取物对尖孢镰刀菌的平均抑菌效果最强，达56%。总的来说各有机萃取剂的萃取物之间抑菌效果并无显著差异性，但和萃取剩余物抑菌效果之间却存在显著差异性，从而也说明6种不同极性的有机萃取剂都能提取出具有对尖孢镰刀菌抑制效果的活性物质。

2.4.2 对沼液的不同处理对腐皮镰孢菌抑制效果的差异性分析

用DPS数据处理系统对实验数据进行单因素方差分析，见表3。

表3 各处理间方差分析

由表3可知，p<0.05，说明各处理间对腐皮镰孢菌的抑菌效果存在显著差异性。其中要属乙醚萃取物的抑菌效果最好，最高可达71%。无菌水对照组抑菌效果最差，甚至出现了促进生长的作用。

表4 各处理间的多重比较分析

注：5%显著水平用小写字母标记；对于不同处理，字母标记相同的数据间不存在差异性，例如ab与ab，字母标记不同的数据间存在显著差异，例如a与bc，字母标记中含有重复字母的数据间不存在显著差异，例如a与ab。1%极显著水平用大写字母标记；对于不同处理，字母标记相同的数据间不存在差异性，例如A与A，字母标记不同的数据间差异达到极显著水平，例如A与B，字母标记中含有重复字母的数据间不存在极显著差异，例如A与AB。

由表4可知，各萃取物和萃取剩余物、浓缩液、原沼液对腐皮镰孢菌的抑菌效果存在极显著差异性。总的来说，苯萃取物对腐皮镰孢菌的平均抑菌效果最佳，达59%。说明对腐皮镰孢菌具有最佳抑菌效果的萃取活性物质和乙酸乙酯具有极相似性。但各萃取物之间对腐皮镰孢菌的抑制效果并无明显差异性，且萃取物的抑菌效果和萃取剩余物之间对腐皮镰孢菌的抑制效果存在极显著差异性，从而也说明每一种有机萃取剂都能从浓缩液中提取到对腐皮镰孢菌有抑制效果的活性物质。

3 结论

6种有机萃取剂都对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌具有一定的抑制效果，且抑制效果随培养时间的增长呈现出先上升后下降的趋势，主要原因是有机溶剂在30℃环境中逐渐蒸发，导致抑制效果变弱。

经6种有机萃取剂萃取过后剩余的液体对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌具有较弱的抑制效果，但在培养3 d后抑菌效果下降迅速，第4天时抑菌率下降为0%。

6种有机萃取剂萃取浓缩液对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌具有较强的抑制效果，且随着培养时间的增加，抑菌效果逐渐增强。另外经萃取提取的物质的抑菌效果强于浓缩液、原沼液、有机萃取剂及无菌水。不同有机萃取剂得到的萃取物的抑菌效果之间并无显著差异性，说明每种有机萃取剂都能萃取出对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌有抑制效果的活性物质。

综上结果可知：各有机萃取剂都能在沼液中提取到对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌有抑制作用的物质，从而使沼液经不同有机萃取剂萃取浓缩后抑菌效果大大加强，最高抑菌率≥60%。各有机溶剂萃取得到的萃取物之间的抑菌效果虽无显著差异性，但总体来说乙醚萃取物抑菌效果最佳，最高抑菌率可达71%。同时萃取过后的剩余液体并无明显的抑菌效果，经萃取前后对比也可看出：有机萃取剂的确是将沼液中的某些抑菌活性物质从沼液浓缩液中萃取浓缩，使萃取剩余物基本失去了抑菌能力。