杜仲叶黄酮的提取方法 及其生物活性研究进展

(陕西学前师范学院生命科学与食品工程学院,陕西西安 710100)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是杜仲科杜仲属多年生落叶乔木,为我国特有的珍贵二类保护物种[1],种植范围广泛,主要分布在湖南、广西、贵州、四川、陕西等地[2],具有清肝明目、壮阳补肾、调整血压、抗疲劳、提高免疫力、延缓衰老等功效,作为一种中药上品在中国已有2000多年历史[3-4]。然而,目前对杜仲的开发利用并不全面,多只局限于杜仲皮和杜仲胶,其中,杜仲皮从古至今一直在中医领域发挥着重要作用,杜仲胶也因其具有优异的橡塑二重性,作为一种天然橡胶被广泛应用于各个行业领域[5-7],在国内外拥有极大的产业覆盖面[8-9],而相比于这两者,资源更为丰富的杜仲树叶却一直缺乏有效的加工利用。研究表明,杜仲叶与皮有相似的化学成分和药理作用[10-11],但在杜仲不同部位中的总黄酮含量有很大差别,以杜仲叶(尤其是老叶)中的总黄酮含量最高,若对其进行提取利用,不仅可以弥补传统药源的不足[12-14],还可以把天然的杜仲叶黄酮应用到各个领域,尤其是食品加工领域。利用杜仲叶及其黄酮提取物多种突出的生物活性,将其作为一种良好的保健品原料和添加剂,开发出营养与保健价值较高的功能性产品,这对食品行业的发展将起到积极的推动作用。本文对目前国内杜仲叶黄酮的提取方法以及近年来杜仲叶黄酮生物活性和机理所做的相关研究进行综述,以期为杜仲叶资源的深度综合开发利用奠定一定的理论基础。

1 杜仲叶黄酮的提取方法

目前,黄酮类的提取方法主要有水提法、溶剂法、超声波提取法、微波提取法、超临界CO2萃取法、酶解法和半仿生提取法。

1.1 水提法

水提法是将杜仲叶粉碎后,按一定的料液比浸入水中,在适宜的温度下浸提一定时间,从而得到含有杜仲叶有效成分浸提液的一种方法。何德飞[15]发现,水提法所选用的料液比和提取时间对杜仲叶中的有效成分提取有显著影响,当料液比为1∶16、提取时间24 h时,杜仲叶中的有效成分含量最高。董兴叶等[16]以杜仲叶为原料,采用亚临界水萃取杜仲叶黄酮类化合物,通过单因素实验及正交试验确定最优工艺条件,结果表明,亚临界水萃取的最优条件为:提取温度120 ℃、提取时间30 min、料水比1∶25 (g/mL)、压力1.0 MPa,此条件下黄酮类化合物得率可达3.09%±0.06%。亚临界水萃取法是在一定的压力下,将水加热到100～374 ℃(水仍然保持液体状态)对黄酮进行提取,该方法相较于传统水提法,能够大幅度缩短提取时间,并提高黄酮类化合物的得率,更适用于工业化生产。

1.2 溶剂法

杜仲叶黄酮不但易溶于水,还易溶于乙醇、甲醇、乙醚等有机溶剂。董娟娥等[17]对提高杜仲叶中主要活性物质的提取率进行了研究,发现黄酮类化合物的最佳提取条件为:以60%乙醇-水混合溶剂在80 ℃下提取3次,每次30 min。叶文峰等[18]通过单因素实验及正交试验探讨了乙醇为溶剂提取杜仲叶总黄酮的最佳提取工艺条件,发现用70%乙醇、料液比为1∶10条件下提取3次,每次回流1.5 h,杜仲叶总黄酮的提取效果最好,回收率可达103.1%。赵文红等[19]分别探究了乙醇浓度、提取温度、提取时间等因素在杜仲叶总黄酮提取中的影响趋势,并以正交实验确定了以12倍量的50%乙醇,在80 ℃条件下回流提取60 min为最佳提取条件,总黄酮得率达3.08%,占固体提取物的31.9%。刘军海等[20]以丙酮-水为溶剂对杜仲叶黄酮的提取工艺进行了研究,结果表明,提取温度65 ℃、丙酮浓度50%、料液比1∶16、提取时间2 h、浸提2次时,总黄酮提取物得率为17.01%,黄酮含量10.96%。综合这些研究结果可以看出,用溶剂法提取杜仲叶黄酮对于提取温度要求较低,提取时间较短,但由于要大量使用有机溶剂,因此该方法更适合小规模提取。

1.3 超声提取法

超声提取法是在溶剂提取的基础上,利用超声作用使原料的细胞壁加速破裂,有效成分更快溶解进入溶剂的方法。郭孝武[21]探讨了超声提取杜仲叶黄酮的最佳工艺,发现采用体积比为40%、料液比1∶60的乙醇水溶液浸泡24 h,再用超声提取45 min,杜仲叶中总黄酮类物质的提出率可达25.43%。路博琼等[22]发现,在50%乙醇作为溶剂时,料液比1∶10 (g/mL),60 ℃下超声提取50 min,杜仲叶黄酮提取物含量较高。罗飞华等[23]通过单因素和正交试验得出了杜仲叶总黄酮的最佳提取工艺条件为:料液比1∶14 (g/mL)、乙醇体积分数50%、超声时间20 min。许先猛等[24]发现,超声功率600 W、时间30 min、乙醇浓度60%、料液比1∶15(g/mL)的条件下黄酮得率最高能达到2.04%。陶亮亮等[25]发现,提取杜仲叶黄酮的最佳工艺条件是乙醇浓度65%、料液比为1∶25、超声时间和温度分别为35 min和65 ℃,黄酮含量可达2.28%。超声辅助提取法对提取液不断的振荡对于有效成分的扩散和溶出有极大的促进作用,能大幅缩短单纯用溶剂提取的时间,降低提取温度,提高黄酮的提取率,具有节能、省时、操作简便等优点。但是由于超声波在传播过程中会发生衰减,作用区域有限,因而对提取罐的直径大小有限制,对于振子和罐体的配合度要求也较高,因此目前在工业化生产应用当中,该方法还存在一定的局限性。

1.4 微波提取法

微波提取法是利用微波的能量加快原料分子的热运动,从而加速破坏细胞壁使有效成分更快提取出来的方法。目前,微波提取法在植物黄酮类物质的提取领域有比较广泛的应用。吕强等[26]对杜仲叶用不同方式进行干燥处理后提取,结果表明,经微波处理后的叶片中总黄酮的质量分数为7.005%,是晒干处理的1.52倍,并且微波杀青后50 ℃烘干处理杜仲叶能够有效减少活性成分的损失。李旭等[27]用响应面曲线法对杜仲叶黄酮的微波提取工艺进行了优化,发现在杜仲叶粉碎颗粒度100目,料液比1∶60 (mL/g),乙醇浓度67%(v/v),微波功率757 W下提取5.3 min,黄酮的得率最高。刘桂萍等[28]发现,微波辅助水提取杜仲叶总黄酮的最佳工艺条件为料液比1∶25 (g/mL),微波功率320 W,提取时间2.5 min,总黄酮提取率可达8.7%。该方法作为一种新型提取工艺,其最大的特点就是能选择性的促使极性分子加速溶出,控制方便、升温速度快,能大幅缩短提取时间,在杜仲叶黄酮工业化提取中有明显优势,生产线组成简单,溶剂选择方面要求较低,具有无污染、低投资的优点,然而该方法对于一些非极性物质的提取效果并不理想。

1.5 超临界CO2萃取法

虽然溶剂提取法提取杜仲叶黄酮的得率较高,被广泛应用,但其存在回收溶剂、对提取温度要求较高等缺陷,相比而言,超临界CO2萃取法以高于临界压力和温度状态下的溶剂,对有效成分进行提取,使细胞壁破碎后释放溶解出更多的有效成分,具有提取效率高、温度要求低、溶剂无残留并能循环利用的优点[29]。李加兴等[30]采用单因素实验和正交试验对杜仲叶黄酮类化合物的最佳萃取工艺条件进行优化,结果表明,添加浓度为80%(v/v)的乙醇水溶液3.5 mL/g 作夹带剂时,最佳萃取条件为:萃取温度40 ℃、萃取压力25 MPa、萃取时间2.5 h、CO2流速200 kg/h,然后将萃取物加1∶3 (v∶v)的乙醚分离出黄酮类化合物,得率可达2.032%(w/w)。李秋红等[31]确定了超临界CO2萃取杜仲叶总黄酮的最佳工艺条件为:温度为45 ℃、时间为2.5 h、压力为30 MPa、夹带剂用量为3.5 mL/g,该条件下黄酮提取率为73.26%,产品纯度为19.82%。王华芳等[32-33]发现,提取工艺条件为温度50 ℃,压强30 MPa,时间120 min时,杜仲叶黄酮的提取率可达10.55%,此外,采用响应面优化法进一步对杜仲叶黄酮的提取工艺进行探究,发现温度51 ℃,压强31.15 MPa,时间90 min,所得总黄酮的含量为45.82 mg/g。综上可知,超临界CO2萃取法在低温条件下进行,能够有效防止沸点低、易挥发的物质在提取过程中的损失,不但操作条件温和,而且提取率较高。由于CO2性质稳定、无毒、对环境无污染,因此超临界CO2萃取法非常适合用于食品行业大规模有效成分的提取和纯化,在工业化生产中萃取压力、温度、萃取颗粒大小、CO2流量、夹带剂的合理选择问题,都是决定提取效果的关键因素。

1.6 酶解法

酶解法提取是一种使用适合的酶处理原材料,使组成细胞的纤维素、半纤维素、果胶等物质结构破除,便于后续提取中有效成分在更短时间内溶出的方法[34]。罗季阳等[35]通过试验确定了纤维素酶是提取杜仲叶活性成分的一种有效酶,在pH4.5,温度55 ℃,加酶量0.01%的条件下提取2.5 h时,杜仲叶活性成分的提取率较高。酶解法提取具有选择性高、反应条件温和的特点,提取效率高,节约能耗的同时,能够使有效成分快速溶解,在成分复杂的中药材提取方面具有重大的应用意义[36]。

1.7 半仿生提取法

半仿生提取法是将原料提取液制成药物制剂,在选定的pH下,模拟药物在胃肠道内的消化转运吸收过程,根据生物药剂学角度而设计出的提取工艺[37]。陈晓娟等[38]以杜仲叶为原料,以磷酸氢二钠-柠檬酸的缓冲溶液作为提取液,用果胶酶酶解2 h后,升温回流提取,黄酮得率达0.043%。邓佑林等[39]研究了半仿生法及超声辅助半仿生法提取杜仲叶黄酮的条件,结果表明,半仿生法在提取时间1.5 h,提取温度60 ℃,料液比1∶20 (g/mL)时,黄酮提取率高达325.0 mg/g;超声波辅助法提取的最佳条件为时间50 min,温度65 ℃,料液比1∶40 (g/mL),黄酮提取率为264.4 mg/g。超声波辅助提取能使提取时间大为缩短,但黄酮的提取率却比半仿生法低。半仿生提取法的特点是提取过程符合口服药物在胃肠道的转运特点,最大限度地将有效成分提取出来并且活性损失较少,尤其是结合酶的作用,不仅能使混合物充分发挥其综合作用,又能利用单体成分控制质量,因此,该方法在中药的有效成分提取和配方研究中有良好优势和广泛的应用前景[40],只是目前在该领域中,半仿生提取法仍沿袭传统的高温煎煮方式,容易破坏药效,有效成分损失较多。

2 杜仲叶黄酮的生物活性

2.1 抗氧化活性

抗氧化是黄酮类化合物的一大特性,关于杜仲叶黄酮是否具有较强的抗氧化活性,有学者进行了以下的研究。李旭等[41]利用微波辅助提取工艺从杜仲叶中提取出总黄酮,探究其对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除作用,发现清除自由基能力明显高于VC,表明杜仲叶黄酮具有较强的体外抗氧化活性。罗飞华等[42]研究发现,杜仲叶黄酮提取物具有较好的还原能力,同时对超氧阴离子有较强的清除作用,且随着黄酮添加量的增大活性增强。此外,贾征等[43-44]对杜仲叶黄酮进行提取并测定了体外抗氧化能力,研究表明,杜仲叶黄酮对羟自由基、超氧阴离子均有较强的清除作用,对红细胞溶血和脂质过氧化有明显的抑制作用,而且随着黄酮添加量的增大而增大,是一种天然有效的抗氧化剂。Lin等[45]对其抗氧化活性的分子机制做了深入研究,发现对大鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞的存活率和凋亡率有剂量依赖性地提高,使Caspase-3/6/7/9的蛋白表达量显著降低。以上研究表明,杜仲叶黄酮抗氧化作用的机理在于清除自由基,对MDA、SOD和GSH-PX等酶在大鼠体内的作用产生影响,减缓脂质过氧化反应程度,并通过多种细胞保护作用发挥抗氧化活性。

2.2 抗疲劳活性

2.3 降血糖活性

由于杜仲叶的次生代谢产物能够阻碍和延缓葡萄糖的吸收,因此杜仲叶具有良好的降血糖功效。Xin等[50]用大鼠建立糖尿病模型,发现杜仲叶提取物能对高血糖大鼠体内的胰岛素发挥长效的积极作用。刑冬杰等[51]研究了杜仲叶黄酮对糖尿病大鼠血糖控制及胰岛细胞的保护作用,发现与对照组相比,杜仲叶黄酮处理组能明显降低糖尿病大鼠胰腺组织中MDA水平、提高SOD及GSH-Px水平,并能降低大鼠的FBG,改善糖耐量,提高FINS水平,胰岛面积增加,细胞数明显增多。Lee等[52]发现,杜仲叶提取物降血糖的同时,能增加血浆中胰岛素和C肽的表达,使糖尿病大鼠胰腺β细胞的功能增强。以上结果表明,杜仲叶黄酮可显著降低血糖,改善糖耐量,其机制之一是能增加FINS水平,降低氧化应激反应,对胰岛细胞具有保护作用。

2.4 降血脂活性

中医认为,杜仲叶不但能护肝保肾,还能降低血脂、减少中性脂肪形成,对于发挥降血脂作用的主要功效成分和相关分子机制,相关学者已经进行了研究。刘静等[53]对杜仲叶黄酮的降血脂作用进行了研究,发现杜仲叶黄酮能降低营养性高脂血症小鼠的血脂,还具有抗氧化作用。雷燕妮等[54]采用微波法提取杜仲叶黄酮,并用其在高血脂动物模型上进行试验,发现杜仲叶黄酮具有良好的降血脂作用。两项研究中,杜仲叶总黄酮都能使高血脂大鼠血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量显著降低,显著升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量,从而有良好的降血脂活性,Choi等[55]探究了杜仲叶提取物对高血脂症金黄地鼠的降脂作用及机制,发现其能显著降低TG、TC、LDL-C和游离脂肪酸的含量,反之提高HDL-C的比例和载脂蛋白A-I的水平,血浆中总胆固醇浓度与肝内HMG-CoA还原酶紧密相关,杜仲叶总黄酮参与调控胆固醇代谢通路是其分子机制之一。

3 杜仲叶应用现状及前景展望

2011年4月,国家发改委发布的“产业结构调整目录”中首次将“杜仲种植生产”列入鼓励类目录中,并启动了杜仲综合利用示范基地的培育工作。作为陕西省秦巴山区丰富的优势资源,杜仲也被列入了陕南循环经济产业发展规划(2009～2020年)需推广规范化种植的药材药源中,亟待全面开发。

目前杜仲皮、杜仲胶的加工技术已经趋于成熟,而大量的杜仲树叶却未得到合理开发利用。长期以来杜仲叶用途单一,主要用来给家禽家畜做功能饲料[56],造成了资源浪费。笔者认为,对于杜仲叶资源的深度开发,未来有两个方向的趋势。第一,将杜仲叶中的有效活性成分进行提取分离后,再把树叶残渣做成动物饲料等进行二次利用。以本文综述的杜仲叶黄酮为例,杜仲叶中黄酮含量高,提取方法多样,并且具有良好的生物活性,可作为一种很好的天然植物黄酮来源。以此类推,从杜仲叶中可提取利用的还有诸如咖啡酸、绿原酸、桃叶珊瑚甙等多种活性物质,这样既发挥了杜仲叶所含有的这些功能性成分的优势,又对叶子进行了充分利用,是未来杜仲叶开发的一大趋势。第二,将杜仲叶作为原料研发成具有保健功能的产品,例如杜仲茶,杜仲固、液体饮料等。在大健康产业发展空间日益扩大的今天,纯天然的植物保健产品将会面临无限的机遇和挑战,对于杜仲这种还不被人们熟知的资源,若能利用其良好的功效性,成功研发出一款产品,将会对人类的健康产生莫大的裨益,对大健康产业的发展起到一定的推动作用,相信这会是杜仲叶开发的又一大趋势。

同时,杜仲叶资源的开发,还将有效促进杜仲林的种植与保护,保护环境的同时提高自然资源利用率,有利于当地农民增收致富,带动种植运输等行业发展,产生显著的环境效益、社会效益和经济效益。