灵芝提取物对高脂膳食大鼠脂质代谢 及粪便菌群的影响

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(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002; 2.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心,福建福州 350002)

脂质代谢紊乱是肥胖、糖尿病、高血脂和非酒精性脂肪肝等的主要危险因素之一[1]。高血脂是一种以升高血液中胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和降低高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)为特点的脂质代谢疾病[2]。许多证据表明:肠道菌群与脂质代谢之间存在着密切的关系[3]。肠道菌群是由数万亿细菌组成的复杂微生物生态系统,被认为是一种隐藏的代谢器官[4]。长期食用高脂食品可以改变肠道菌群的整体结构,增加脂质代谢紊乱相关疾病的风险[5]。目前,治疗脂质代谢紊乱药物以他汀类为主,然而长期服用他汀类药物,易产生各种不良反应[6]。因此,寻求天然活性物质对改善脂质代谢紊乱成为研究热点。

天然三萜类化合物具有广泛的生物活性[7]。三萜类化合物主要存在于双子叶植物,其中游离三萜类主要分布在豆科、鲁宾科和唇形科等植物[8]。目前,三萜化合物的活性研究主要围绕抗氧化、护肝、抑制肿瘤和提高免疫力方面[9]。李森等人从泽泻中分离出三萜能够降低高脂饮食诱导高血脂症小鼠的血脂水平[10],但关于灵芝三萜的降血脂活性及其调节肠道菌群的研究鲜有报道。本实验室前期研究表明灵芝55%醇提物富含三萜类物质,主要包括15种化合物[11]。本研究通过高脂饮食诱导Wistar大鼠形成脂质代谢紊乱模型,观察灵芝55%醇提物对脂质代谢紊乱大鼠粪便菌群的影响,初步探讨灵芝55%醇提物预防脂质紊乱的可能性作用机制,为进一步开发治疗高脂饮食引发脂质代谢紊乱提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

基础饲料 福建省福州市吴氏实验动物提供;高脂饲料 参照罗喜钢的饲料配方[12];灵芝 采购于福建农林大学国家工程技术研究中心;无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司;TG、TC、HDL-C和LDL-C试剂盒 南京建成科技有限公司;10%水合氯醛 购于福州总院;清洁级Wistar大鼠24只(170±20) g 购于山东省实验动物中心(No.SCXK2017-0005)。

日立7060全自动生化分析仪 日立有限公司;电子天平 深圳市德优平科技有限公司;低温高速离心机 北京时代北利离心机有限公司;-80 ℃冰箱 青岛海尔股份有限公司;荧光定量PCR 美国应用生物系统公司;酶标仪 美谷分子仪器(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 灵芝醇提物制备 灵芝子实体在70 ℃干燥后,粉碎过60目,按料液比为1∶30加入95%乙醇,在60 ℃下浸泡120 min后过滤。取滤渣按1∶30加入55%乙醇,在60 ℃下浸泡120 min后过滤,减压浓缩,冷冻干燥,备用。实验室前期发现使用此提取方法提取灵芝醇提物的提取率较高[11]。

1.2.2 动物实验设计 大鼠经过7 d适应性喂养后,将实验动物任意平分为3组,分别为:空白组(基础饲料,NFD)、模型组(高脂饲料,HFD)和干预组(高脂饲料+150 mg/kg·d灵芝55%醇提物,GLE),每次灌胃2 mL,喂养8周。在实验第4周和第8周时,早上8点开始收集老鼠粪便,并保存于-80 ℃冰箱。实验结束前一天,禁食12 h,利用10%水合氯醛对实验动物进行麻醉,采用心脏取血方式收集血液,并迅速取出肝脏用液氮速冻,转移至-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 血清及肝脏生化指标检测 采用心脏采血,室温条件下静置30 min,4000 r/min离心10 min,取上清液。利用全自动生化分析仪对大鼠血清生化指标(TG、TC、LDL-C和HDL-C)进行检测。

称取100 mg 肝脏组织置于2 mL离心管,用生理盐水洗掉表面杂质,再按重量体枳比1∶9加入生理盐水,用眼科剪刀将肝脏组织剪碎,然后将其插入冰中,使用组织匀浆机对其组织进一步破碎,离心(9500 r/min,5 min),取上清,测定TG、TC、LDL-C和HDL-C水平。

1.2.4 肝脏中RNA提取及RT-PCR反应 肝脏RNA的提取参照易凡琪等[13]的提取方法,并使用cDNA逆转录试剂盒合成cDNA,-80 ℃保存。最后以β-actin基因为内参基因,按照Takara试剂盒要求进行扩增,通过检测SYBR Green I荧光强度,达到监控其产物增量的目的,采用2-ΔΔCt值法计算与NFD组的相对表达量。其引物设计如表1:

表1 基因和引物序列Table 1 Gene and sequences of primers

1.2.5 粪便菌群总DNA提取和高通量测序分析 利用试剂盒提取大鼠粪便中总DNA,并在低温条件下送往上海态昌基因科技有限公司,对样品进行PCR扩增及高通量测序。

针对16S RNA基因中V3～V4区,合成带有的特异引物(正向引物:5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC A-3′,反向引物:5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′)。然后产物在2%琼脂糖凝胶上观察,然后用Axygene DNA凝胶提取试剂盒(Corning,NY)进行纯化,将PCR产物归一化后,后续测序由上海态昌基因科技有限公司完成。

1.3 数据处理

2 结果与讨论

2.1 灵芝提取物(GLE)对高脂大鼠血液生化指标的影响

由表2可知,与NFD组相比,高脂膳食大鼠血清中TG、TC和LDL-C水平极显著性升高(p<0.01),而极显著性降低HDL-C水平(p<0.01)。研究表明,血清中胆固醇每降低1%,患心血管疾病风险降低2%～3%[14],而LDL-C升高会增加突发性心血管疾病的发病率[15]。此外,HDL-C降低易引发冠心病[16]。与HFD组相比,口服GLE能显著降低血清中TG、TC和LDL-C的水平(p<0.05),而HDL-C水平变化并无显著差异(p>0.05)。说明灵芝55%醇提物能有效改善高血脂症大鼠的血液生化指标(除HDL-C外)。

表2 灵芝提取物对高脂饮食大鼠血脂的影响Table 2 Effect of GLE on blood lipid in high-fat diet fed

2.2 灵芝提取物(GLE)对高脂大鼠肝脏指数的影响

肝脏是人体脂质代谢重要的器官,肝脏中TG、TC、HDL-C和LDL-C水平能有效反映肝脏状态。与NFD组相比(图1),HFD组中大鼠肝脏中TG、TC和LDL-C水平均显著升高(p<0.01),而与HFD组相比补充GLE均能得到显著降低(p<0.05)。肝脏中TC含量降低可能是过量的胆固醇转化为胆汁酸排出体外[17]。此外,高脂饮食会降低肝脏中HDL-C水平(p<0.01),但口服GLE能使HDL-C水平接近空白组(p>0.05)。

图1 灵芝提取物对高脂饮食大鼠肝指标的影响Fig.1 Effects of GLE on the hepatic TG,TC,HDL-C and LDL-C levels in high-fat diet fed rats注：##表示与空白组相比差异极显著(p<0.01),#表示与空白组相比差异显著(p<0.05); **表示与模型组相比差异极显著(p<0.01),*表示与模型组相比差异显著(p<0.05)，图2同。

2.3 灵芝提取物(GLE)对相对mRNA表达量的影响

由图2可知,与NFD组比较,HFD组大鼠肝组织中与脂质代谢相关的过氧化物酶体增殖剂激活受体α(PPARα)mRNA表达量极显著下调(p<0.01),同时显著增加固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1C)(p<0.05),极显著增加了载脂蛋白B(ApoB)的表达量(p<0.01)。PPARα可增加脂肪酸的氧化,进而减少肝脏中脂质积累[18]。此外,PPARα可有效提高血浆HDL-C水平,降低动脉粥样硬化的风险[19]。与模型组比较,灵芝提取物可极显著提高PPARα表达水平(p<0.01),减少脂质在肝脏中的积累。SREBP-1c主要负责ACC1基因在肝脏中的表达,进而达到调节血液中TG水平[20]。ApoB水平的升高,会导致血清中TG 水平的上升,引发高胆固醇血症[21]。灵芝提取物也极显著抑制高脂膳食诱导ApoB水平升高(p<0.01),使ApoB表达水平接近空白组(p>0.05)。

图2 灵芝提取物对高脂饮食大鼠相对mRNA表达的影响Fig.2 Effects of GLE on relative expression of mRNA in high-fat diet fed rats

2.4 灵芝提取物(GLE)对菌群结构的影响

由图3A可知,同一实验组第4周和第8周处于同一小类,说明同一实验组的不同时期的菌群结构具有较高相似性。由聚类分析可知,GLE组中粪便菌群结构与HFD组菌群结构处于同一大类。但GLE组处于NFD和HFD组之间,说明GLE菌群结构存在向空白组变化的趋势。由图3B的主成分分析可知,空白组和模型组分别处于不同象限,说明饮食结构能显著改变粪便菌群结构,但灵芝提取物能有效改善高脂诱导粪便菌群结构,使其向空白组菌群结构发展。

由图3C和3D可知,灵芝提取物能改善高脂饮食引起粪便菌群结构的变化。与模型组相比,服用灵芝提取物能有效改善菌群结构,其中粪便中囊杆菌属属(Asaccharobacter)、梭菌属(ClostridiumXIVb)、瘤胃球菌(Ruminococcus2)和粪球菌属(Coprococcus)的丰富度均有减少,而乳酸杆菌属(Lactobacillus)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、萨特菌属(Sutterella)、另枝菌属(Alistipes)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)和巴氏杆菌属(Barnesiella)的丰富度均有增加。然而,服用灵芝提取物8周时,粪便中考拉杆菌属(Phascolsrctobacterium)、粪球菌属(Coprococcus)、萨特菌属(Sutterella)、脱硫化弧菌属(Desulfovibrio)的丰富度均有升高;而厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)、多尔氏菌属(Dorea)、链球菌属(Streptococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)和帕拉普氏菌属(Paraprevotella)的丰富度均有降低。

图3 灵芝提取物对高脂饮食大鼠相关mRNA表达的影响Fig.3 Effects of GLE on gut microbiota composition in high-fat diet fed rats注:NFD_M、HFD_M和GLE_M分别表示第4周空白组、模型组和干预组, NFD_F、HFD_F和GLE_F分别表示第8周空白组、模型组和干预组。

有研究表明:链球菌属(Streptococcus)的减少可有效预防和治疗炎症,并可控制机体肥胖[22];帕拉普氏菌属(Paraprevotella)丰富度与饮食有关,拉普氏菌属(Paraprevotella)丰富度越高，机体患病概率越高[23]。灵芝提取物可有效增加粪便中考拉杆菌属(Phascolsrctobacterium)、萨特菌属(Sutterella)和粪球菌属(Coprococcus)丰富度,考拉杆菌属、萨特菌属和粪球菌属是短链脂肪酸的主要生产微生物,其中丁酸是结肠上皮细胞营养的主要来源[24-25],此外短链脂肪酸还具有抗炎和调节肠道免疫[26]。实验结果表明灵芝提取物能有效改善粪便菌群结构。

3 结论

灵芝55%醇提物能有效降低血清和肝脏中TG、TC和LDL-C含量,同时提高肝脏中HDL-C含量。用灵芝55%醇提物干预大鼠的高脂膳食,可有效降低肝脏中mRNA(SREBP-1C)水平,并提高PPARα水平。此外,灵芝55%醇提物显著提高粪便中考拉杆菌属(Phascolsrctobacterium)、粪球菌属(Coprococcus)、萨特菌属(Sutterella)和脱硫化弧菌属(Desulfovibrio)的丰富度;并显著降低厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)、多尔氏菌属(Dorea)、链球菌属(Streptococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)和帕拉普氏菌属(Paraprevotella)的丰富度。研究结果为预防脂质代谢紊乱和肠道菌群失调提供可靠的理论依据。