响应面法优化超临界CO2 流体萃取淮山多糖工艺

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(湖南化工职业技术学院,湖南株洲 412004)

淮山(DioscoreaoppositaThunb.)在我国有广泛的种植,是传统的药食两用植物[1]。淮山多糖具有降低血糖[2]、调节和增强免疫功能、抗氧化、抗衰老、抗突变等作用[3],从淮山中提取多糖,对充分利用淮山资源、促进淮山产业经济的发展具有重要意义。

目前淮山多糖的提取方法主要有热水浸提、碱法提取[4]、微波辅助提取[5]、超声波辅助提取[3]等,这些方法使淮山多糖生物活性降低,同时使用的溶剂量较大,造成后续分离的困难。超临界流体萃取、亚临界萃取技术是近几十年新发展起来的提取技术,具有能耗小、效率高、无污染、条件温和等优点[6-8],能够在保持萃取物生物活性的同时降低后续分离难度。研究表明[9-12],超临界流体萃取、亚临界萃取技术在萃取黑木耳多糖、香菇多糖、金针菇多糖时,相较于传统方法,多糖萃取率有显著提升。

本试验采用超临界CO2流体萃取技术,考察萃取温度、萃取压力、萃取时间、夹带剂乙醇浓度四个因素,利用响应面分析法对淮山多糖的萃取工艺进行优化,为淮山多糖的进一步研究和开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

淮山 株洲市湘天桥菜市场,并经鉴定为淮山(DioscoreaoppositaThunb.);D-无水葡萄糖标准品(纯度>99.9%) 中国食品药品检定研究院;乙醚 天津富宇精细化工有限公司;苯酚 天津市永大化学试剂有限公司;硫酸 成都市科龙化工试剂厂;所有试剂均为国产分析纯。

HA121-50-01型超临界萃取装置 江苏南通华安超临界萃取有限公司;UV-2550型紫外可见分光光度计、AUW220D型分析天平 岛津制作所;DHS-20A自动快速水分测定仪 上海力辰仪器科技有限公司;DZ24T型真空干燥箱 天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 淮山多糖的萃取 取新鲜的淮山去除杂质、洗净,60 ℃真空干燥,快速水分测定仪检测其含水量小于5%。粉碎成一定目的颗粒,用10倍乙醚浸提3次脱脂,挥发去样品中的乙醚,样品置干燥器中干燥,备用。称取经乙醚脱脂处理的淮山样品300 g,应用超临界CO2流体萃取装置萃取淮山多糖;萃取物于50 ℃下真空减压浓缩,浓缩液按1∶3 (V/V)比例加入无水乙醇,静置过夜,过滤,将过滤得到的沉淀物置表面皿上真空干燥后得淮山粗多糖。

1.2.2 单因素实验 按照1.2.1方法萃取淮山粗多糖,探究夹带剂用量为100 mL时,萃取温度(20、30、40、50、60 ℃)、萃取压力(20、25、30、35、40 MPa)、萃取时间(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)、夹带剂乙醇浓度(0、20%、40%、60%、80%)、样品粒度(10、30、50、70、90目)5个因素对多糖得率的影响。萃取温度、萃取压力、带剂乙醇浓度和样品粒度5个因素的固定水平分别为50 ℃、35 MPa、2.0 h、60%和40目,在对各因素进行单因素实验探究时,其他因素均取固定水平。

1.2.3 响应面分析法优化多糖提取工艺参数 以淮山多糖萃取得率为考查指标,在单因素实验基础上,选取超临界CO2流体萃取淮山多糖的萃取温度、萃取压力、萃取时间、夹带剂乙醇浓度为试验因素,根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,采用四因素三水平的响应面分析法优化淮山多糖的提取工艺参数。试验因素及水平见表1。

表1 响应面分析因素及水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.2.4 淮山多糖萃取得率的计算

1.2.4.1 标准曲线的制作 准确称取干燥至恒重的无水葡萄糖标准品1.0 g,配成浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖对照品贮备液,从中分别精密吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于25 mL具塞试管中,各加水至1.0 mL,各加5%苯酚溶液1.5 mL,振摇混匀,滴加浓硫酸5.0 mL,迅速振摇均匀,于50 ℃下放置30 min,取出后冷却至室温,紫外可见分光光度法于490 nm波长下测定吸光度值[13-14],以样品浓度x(μg/mL)为横坐标,以吸光度值y为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4.2 淮山多糖的测定 精密称取1.2.1法制备的淮山粗多糖0.5 g,溶解,定容于100 mL容量瓶中;从中精密量取1.0 mL,定容于100 mL容量瓶中,制成待测样品溶液;精密量取待测样品溶液1.0 mL,按1.2.4.1法测定淮山粗多糖吸光度值,对照标准曲线计算淮山多糖含量,计算萃取得率[13-14]。

淮山多糖萃取得率(%)=C×V/m×100

其中:C:淮山多糖质量浓度,g/mL;V:经超临界萃取所得萃取物样品溶液体积,mL;m:淮山样品质量,g。

1.3 数据处理

数据分析采用Design-Expert.V 8.0.6进行试验设计和数据处理。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

以样品浓度x(μg/mL)为横坐标,以吸光度值y为纵坐标绘制标准曲线为:y=0.00626x-0.0038,R2=0.9991,在0～100 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

图1 葡糖糖标准曲线图Fig.1 Glucose standard curve

2.2 单因素实验

2.2.1 超临界CO2流体萃取温度对淮山多糖萃取得率的影响 由图2可知温度对淮山多糖萃取得率的影响明显。在20～40 ℃范围内,随着温度的升高,淮山多糖萃取得率不断提升,这可能是由于温度升高,加速了CO2流体的热运动,同时也提高了多糖分子热运动,加速了淮山多糖的溶出和转移;在40～50 ℃范围内,淮山多糖萃取得率随温度升高变化不大,这可能是由于淮山原料颗粒内外多糖转移达到平衡所致;萃取温度高于50 ℃时,萃取得率随温度的升高而缓慢下降,这可能是在压力一定的情况下,超临界CO2流体密度随着温度升高而降低,溶剂化效应下降,淮山多糖在其中的溶解度降低导致萃取得率下降,也可能是部分多糖在较高温度下被氧化、分解,导致多糖萃取得率降低。因此,萃取温度选取50 ℃。

图2 萃取温度对淮山多糖萃取得率的影响Fig.2 Effects of extraction temperature on the yield of polysaccharides from Dioscorea opposite Thunb

2.2.2 超临界CO2流体萃取压力对淮山多糖萃取得率的影响 由图3可知,在20～30 MPa范围内,淮山多糖的萃取得率随着压力的增大而不断升高,这可能是因为在温度一定的条件下,超临界CO2流体的密度随压力的升高而升高,流体溶剂化效应增强,淮山多糖的溶出增加、溶解度加大导致的;在30～40 MPa范围内,淮山多糖的萃取得率随超临界CO2流体压力的增加变化不大,这可能和萃取压力增加,超临界CO2流体密度增加,扩散性降低,淮山多糖传质速率降低,与压力升高导致的溶解度增大之间达到平衡有关;同时萃取压力增大也会导致设备、操作费用的升高。因此,萃取压力选取35 MPa。

图3 萃取压力对淮山多糖萃取得率的影响Fig.3 Effects of extraction pressure on the yield of polysaccharides from Dioscorea opposite Thunb

2.2.3 超临界CO2流体萃取时间对淮山多糖萃取得率的影响 由图4可知,在1～2 h时间范围内,淮山多糖的萃取得率随萃取时间的延长而提高,这可能是因为淮山多糖在短时间内不能充分溶出,萃取时间延长,淮山多糖从原料颗粒中充分溶出导致的。在2～2.5 h时间范围内,萃取得率随萃取时间的延长变化不大,这可能是淮山多糖的溶出达到平衡所致;在2.5～3 h时间范围内,萃取得率随萃取时间的延长而降低,可能是因为有部分淮山多糖被氧化、分解所致。因此,萃取时间选取2.5 h。

图4 萃取时间对淮山多糖萃取得率的影响Fig.4 Effects of extraction time on the yield of polysaccharides from Dioscorea opposite Thunb

2.2.4 超临界CO2流体萃取夹带剂乙醇浓度对淮山多糖萃取得率的影响 由图5可知夹带剂浓度能明显改变超临界CO2流体的萃取性能。在未添加夹带剂的情况下,由于超临界CO2流体的弱极性和淮山多糖的不挥发性,淮山多糖的萃取得率较低;随着夹带剂浓度在0～60%之内增加,超临界CO2流体的极性改变,淮山多糖萃取得率随之提高;当夹带剂浓度在60%～80%内增加时,淮山多糖萃取得率随夹带剂浓度的升高而降低,这可能是因为乙醇浓度过高,淮山多糖在其中的溶解度降低导致的。因此,夹带剂乙醇浓度选取60%。

图5 萃取夹带剂乙醇浓度对淮山多糖萃取得率的影响Fig.5 Effects of extraction cosolvent on the yield of polysaccharides from Dioscorea opposite Thunb

2.2.5 淮山粒度对淮山多糖萃取得率的影响 由图6可知,淮山粒度对多糖得率影响不明显。淮山粒度在10～50目范围内增加时,淮山多糖的萃取得率随之增加,这可能是由于在此粒度范围内,原料颗粒减小,超临界CO2流体能够进入颗粒内部进行充分交换所致。当粒度在50～70目范围内增加时,淮山多糖萃取得率变化不明显;当粒度在70～90目范围内增加时,淮山多糖的萃取得率减少,这可能是较小的淮山样品粒度在萃取过程中发生结块现象,导致多糖溶出减少所致;也可能是较小的淮山颗粒堵塞萃取隔板小孔,使萃取产物不能及时转移到分离缸造成的。因50～70目时的萃取得率无显著性差异,趋势基本平稳,为了操作方便,后续实验固定淮山样品粒度为60目。

图6 淮山粒度对淮山多糖萃取得率的影响Fig.6 Effects of particle size on the yield of polysaccharides from Dioscorea opposite Thunb

2.3 响应面试验结果

通过响应面法对超临界CO2流体萃取淮山多糖的温度、压力、时间、夹带剂乙醇浓度4个因素进行设计,试验方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental desigen and results for response surface analysis

采用Design-Expert.V8.0.6软件对数据进行回归拟合,得淮山多糖萃取得率Y对各因素回归方程为:Y=0.26+0.016A+0.042B-3.333×10-3C+7.500×10-3D-7.500×10-3AB-1.000×10-2AD+0.033BD+1.000×10-2CD-8.917×10-2A2-0.025B2-7.667×10-3C2-0.049D2

表3 回归模型与方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

该模型拟合程度好,结果可靠,可以用该模型对淮山多糖萃取结果进行分析和预测。由回归方程和方差分析可知,模型中A、B、BD、B2、D2对淮山多糖萃取得率的影响为极显著(p<0.01);D对淮山多糖萃取得率的影响为显著(p<0.05)。各因素对淮山多糖萃取得率的影响依次为B>A>D>C,即萃取压力>萃取温度>夹带剂浓度>萃取时间。

2.3.1 响应面分析 图7表示各影响因素两两作用对淮山多糖萃取得率的交互影响。由图7a可知,萃取温度与萃取压力对淮山多糖萃取得率的交互作用不显著(p=0.2116>0.05)。压力一定时,多糖萃取得率随温度升高而增加;温度一定时,多糖萃取得率随压力升高而升高。由图7b可知,萃取温度与萃取时间对淮山多糖萃取得率的交互作用不显著(p=1.00>0.05)。由图7c可知,萃取温度与夹带剂浓度对淮山多糖萃取得率的交互作用不显著(p=0.1028>0.05)。由7d可知,萃取压力与萃取时间对淮山多糖萃取得率的交互作用不显著(p=1.00>0.05)。由图7e可知,萃取压力与夹带剂浓度对淮山多糖萃取得率的交互作用极显著(p<0.01)。夹带剂浓度较低时,多糖萃取得率随压力的升高而先升高后降低;夹带剂浓度较高时,多糖萃取得率随压力的升高而升高;压力较低时,多糖萃取得率随夹带剂浓度增加而先升高后略有降低;压力较高时,多糖萃取得率随夹带剂浓度增加先略有升高后降低。由图7f可知,萃取时间与夹带剂浓度对淮山多糖萃取得率的交互作用不显著(p=0.1028>0.05)。

图7 各因素交互作用对淮山多糖萃取得率的影响Fig.7 Response surface plots for the effects of any two variables on extraction rate of polysaccharides

2.3.2 最佳条件的预测及验证实验 通过建立的模型预测淮山多糖的最佳萃取工艺为:萃取温度52.50 ℃、萃取压力45.00 MPa、萃取时间2.53 h、夹带剂乙醇浓度67.72%,理论萃取得率为0.287%。考虑到操作的实际情况,将最佳工艺条件修订为:萃取温度53 ℃、萃取压力45 MPa、萃取时间2.5 h、夹带剂乙醇浓度68%。在此工艺条件下进行验证实验,做重复试验3次,淮山多糖萃取得率平均为0.2807%±0.0045%,与预测值较为接近,表明该模型能够模拟和预测淮山多糖的萃取,模型可靠。

3 结论

应用响应面法优化超临界CO2流体萃取淮山多糖的工艺,结果显示二次响应面模型拟合度较高,可用于淮山多糖提取预测与优化。萃取温度、萃取压力及夹带剂浓度对多糖萃取得率作用显著(p<0.05),萃取压力和夹带剂浓度之间存在极显著(p<0.01)交互作用。超临界CO2流体萃取淮山多糖的最佳工艺条件为:萃取温度53 ℃、萃取压力45 MPa、萃取时间2.5 h、夹带剂乙醇浓度68%,该条件下淮山多糖萃取得率为0.2807%±0.0045%。本研究为淮山多糖的提取工艺提供了参考,为淮山多糖的进一步研究和应用奠定了基础。