响应面法优化鲣鱼(Katsuwonus pelamis) 内脏鱼油酶法提取工艺

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(1.浙江国际海运职业技术学院,浙江舟山 316021; 2.浙江海洋大学食品与医药学院,浙江舟山 316022)

鱼类内脏是鱼类精深加工产生的副产物之一,对鱼类内脏进行综合利用,不仅可以使资源得到充分利用,提升鱼体本身经济价值,还可以减少废水废物的排放,对保护环境有着积极意义。鱼类内脏含有丰富的鱼油,鱼油中主要成分DHA和EPA等多不饱和脂肪酸的含量丰富[1],是很好的蛋白质来源,并且是便于人体吸收利用的健康食品[2-4],对人体正常发育和保持健康有着重要意义,可预防和治疗多种疾病[5-6]。幼儿及青少年及时补充DHA和EPA,可促进视力以及智力发育,中老年人及时补充可预防延缓由衰老所带来的一系列疾病[7-9]。

鲣鱼(Katsuwonuspelamis)是全球金枪鱼渔业中重要的目标鱼种之一[10-11]。据联合国粮农组织资料统计,鲣鱼的产量约占世界主要金枪鱼总产量的40%以上[12]。高颐雄[13]发现扁舵鲣的总脂肪高达13.2%,且n-3多不饱和脂肪酸质量分数最高为2.62%。也有研究报道,鲣鱼等大型洄游性鱼的内脏中含有30%～40% DHA以及5%～10%EPA[14-15]。

目前,越来越多的国内外专家学者正在研究鲣鱼内脏不同酶解条件以及酶解产物的功能特性,以及鲣鱼鱼油萃取和精炼技术。酶解法是利用蛋白酶水解破坏蛋白质和脂肪之间的结构释放油脂[16]。郝淑贤等[17]以鲟鱼内脏为原料,通过碱性蛋白酶对鲟鱼内脏进行酶解,研究了枯草杆菌酶法提取鲟鱼鱼油的工艺条件,比较不同提取方法对鱼油品质的影响。郝记明等[18]研究从罗非鱼副产物中提取鱼油的工艺,以鱼油提取率为指标,考察中性蛋白酶的最佳提取条件,利用中性蛋白酶进行酶解时鱼油提取率提高。汤小会[19]以竹家鱼加工副产物为原料,采用蒸煮法和胰蛋白酶酶解两种方法提取鱼油,以提取率和感官评分为考察指标,分别对两种提取工艺参数进行了优化研究,实验表明胰蛋白酶酶解法明显比蒸煮法好。吴祥庭[20]采用中性蛋白酶提取鲐鱼鱼油,利用响应面优化分析法对酶法鲐鱼最佳酶解工艺参数进行研究,得出最佳酶法水解条件为酶量为1000 U/g原料、pH7.3、45 ℃。洪鹏志等[21]考察木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解金枪鱼头蛋白,确定了金枪鱼头的蛋白水解条件。总之,不同种类蛋白酶对不同鱼类鱼油提取率的影响有所不同,采用酶解法提取鲣鱼鱼油时,酶的种类的选择及其最佳酶解工艺有待进一步研究。

酶法提取可温和且有效保护油脂组分,能够充分释放原料中的油脂,从而提高鱼油品质和鱼油提取率[22],该工艺条件对鲟鱼内脏鱼油的提取效果明显好于氨法、钾法和蒸煮法,酶解后的物质还可进一步加工用于食品或饲料工业,工艺操作简单,生产安全性高,是一种低投资、无污染的生产技术。本研究以鲣鱼内脏为原料,以鱼油提取率为指标,由五种蛋白酶中选取酶解效果最佳的蛋白酶,以期得到提取鲣鱼内脏鱼油时的最佳工艺条件,为鲣鱼内脏的综合利用提供基础数据和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲣鱼内脏 由浙江兴业集团有限公司提供,-18 ℃冷冻储藏;乙醇、盐酸、石油醚、冰醋酸和氢氧化钠(均为分析纯)、胰蛋白酶(50000 U/g)碱性蛋白酶(30000 U/g) 购自国药化学试剂有限公司；胃蛋白酶(30000 U/g)、木瓜蛋白酶(10000 U/g)、风味蛋白酶(50000 U/g) 购自武汉市华顺生物科技公司。

101A型电热鼓风干燥箱 上海浦东跃兴科学仪器厂;DK-16型恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司;FA24S型电子分析天平 上海天平仪器厂公司;F20K型pH计 上海精密仪器有限公司;NZ-100型高速均质机 上海爱朗仪器有限公司;SHA-C型水浴恒温振荡器 常州国华电器有限公司;98-1-B型电子调温电热套 天津泰斯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼油提取工艺 将冷冻鲣鱼内脏取出解冻,清洗干净,用高速均质机打碎至糊状,-18 ℃冷冻备用。按一定液固比(g/g)加入蒸馏水打浆,加入稀盐酸或氢氧化钠调节pH,加入相应的蛋白酶开始酶解,一段时间后结束酶解,沸水浴10 min灭酶,冷却后离心(5000 r/min,20 min)。取上清液,分离得到鱼油。

1.2.2 鱼油提取率的测定 粗脂肪含量根据GB/T 24870-2010 粮油检验大豆粗蛋白质、粗脂肪含量的测定。

式中:R为鱼油提取率(%),m1为所得鱼油质量,m2原料中粗脂肪含量。

1.2.3 最适酶的选择 以鱼油提取率为评价指标,采用胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶在其各自最适温度(反应温度)与pH下对鲣鱼内脏进行酶解,上述不同种类蛋白酶的反应温度和pH见表2。同时酶添加量为2%,液固比为1∶1,酶解时间为5.5 h,选择酶解鱼油最合适的蛋白酶。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 酶解时间对鱼油提取率的影响 取酶解时间为4、4.5、5、5.5、6、6.5 h,其他酶解条件为液固比1∶1 (g/g,下同)、pH8.5、温度55 ℃、酶添加量2%,考察鲣鱼内脏鱼油的提取率。

1.2.4.2 酶解温度对鱼油提取率的影响 酶解温度为45、50、55、60、65 ℃,其他酶解条件为液固比1∶1、pH8.5、时间5.5 h、酶添加量2%,考察鲣鱼内脏鱼油的提取率。

1.2.4.3 酶添加量对鱼油提取率的影响 取酶添加量为1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%,其他酶解条件为液固比1∶1、pH8.5、温度55 ℃、时间5.5 h,考察鲣鱼内脏鱼油提取率的变化。

1.2.4.4 pH对鱼油提取率的影响 取pH为7.5、8.0、8.5、9.0、9.5,其他酶解条件为液固比1∶1、温度55 ℃、时间5.5 h、酶添加量2%,考察鲣鱼内脏鱼油的提取率。

1.2.4.5 液固比对鱼油提取率的影响 取液固比为0.4∶1、0.7∶1、1∶1、1.3∶1、1.6∶1，其他酶解条件为温度55 ℃、时间5.5 h、pH8.5、酶添加量2%,考察鲣鱼内脏鱼油的提取率。

1.2.4.6 响应面优化实验 碱性蛋白酶酶解响应面优化实验因素和水平表见表1,通过碱性蛋白酶单因素试验的结果分别选取酶添加量(A)、pH(B)和液固比(C)三个因素并设立三个水平进行鲣鱼内脏鱼油提取工艺的优化。

1.3 数据处理

数据处理及作图采用Origin 8.1、SPSS 13.0统计分析软件,采用SNK法分析测验显著性水平,p<0.05。

2 结果与分析

2.1 酶种类的选择

采用胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶在其各自最适温度与pH下对鲣鱼内脏进行酶解,不同蛋白酶对鱼油提取率的影响如表2所示。除胃蛋白酶(28.25%)外,其余蛋白酶的鱼油提取率均超过了40%,提取率最高的蛋白酶是碱性蛋白酶为57.46%,因此,选用碱性蛋白酶作为提取鲣鱼内脏鱼油的蛋白酶。

表2 不同种类蛋白酶对鲣鱼内脏的酶解效果Table 2 The enzymolysis effect of different kinds of proteases on Katsuwonus pelamis viscera

2.2 酶解时间对鱼油提取率的影响

图1表示酶解时间对鲣鱼内脏鱼油提取率的影响。由图1中可知,鲣鱼内脏鱼油的提取率随时间增加而提升,但酶解时间大于5.5 h时,鱼油提取率增速有明显的下降,原因可能为随着时间的增加,碱性蛋白酶与底物充分接触,作用状态基本达到平衡。此外,随着时间的延长,多不饱和脂肪酸发生氧化[23]，鱼油颜色也逐渐加深。综上,选择最适酶解时间为5.5 h。

图1 不同酶解时间对鱼油提取率的影响Fig.1 Effect of different enzymatic hydrolysis time on extraction rate of fish oil

2.3 酶解温度对鱼油提取率的影响

图2所示为不同酶解温度对鲣鱼内脏鱼油提取率的影响。由图2可知,鱼油提取率随着温度的上升先增大后减小,这可能是因为蛋白酶生理活性在最适温度时达到最高,温度过高或过低酶的活性均会受到影响。在一定范围内,酶活性与酶解温度成正比,体系内分子的热运动加快,酶解效率升高,酶促反应也更加完全;一旦超过了其最佳温度,蛋白酶失去活性,降低酶与底物的反应[24]。同时温度过高会加快鱼油的氧化,导致鱼油提取率下降,品质降低。综上所述,较适宜的酶解温度为55 ℃。

图2 不同酶解温度对鱼油提取率的影响Fig.2 Effects of different enzymatic hydrolysis temperatures on the extraction rate of fish oil

2.4 酶添加量对鱼油提取率的影响

酶添加量对鲣鱼内脏鱼油提取率的影响如图3所示,由图3可看出,随着碱性蛋白酶添加量的增加,鱼油提取率呈现先增大后减小的趋势。当碱性蛋白酶添加量为2.0%时,鲣鱼内脏鱼油的提取率达到最大值。原因是当酶与底物未达到饱和时,增加酶量可促进蛋白质的水解,当达到饱和时,过度酶解导致小分子部分与油脂又发生乳化,产生絮状类物质,使鱼油提取率降低。结果表明,较适宜的酶添加量为2.0%。

图3 不同酶添加量对鱼油提取率的影响Fig.3 Effects of different addtive amout of enzymes on the extraction rate of fish oil

2.5 酶解pH对鱼油提取率的影响

酶解pH对鲣鱼内脏鱼油提取率的影响结果如图4所示。随着pH的提升,鱼油提取率先增加后下降,当pH达到8.5时,鲣鱼内脏鱼油达到最大值57.30%,这是由于底物和蛋白酶的带电性都会受到不同酸碱值的影响,同时酸碱值还会影响酶分子的稳定性[25],在一定条件下,酶在最适pH时活性最强。鲣鱼内脏鱼油提取率最高时pH为8.5,此时酶的活性最高,酶解效果最好。

图4 酶解pH对鱼油提取率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis pH value on fish oil extraction rate

2.6 液固比对鱼油提取率的影响

液固比对鲣鱼内脏鱼油提取率的影响如图5所示。

由图5可知,当液固比小于1∶1时,酶解的效果与蒸馏水量成正比,随着水量增加,鱼油提取率也随之提高。此条件下,系统水分的增加有助于蛋白酶更好地作用于底物,提高酶解速度,增加酶解程度,同时脂肪也易于溶出。但是水量一旦超过限度,水分的增加致使底物浓度降低,造成酶解不完全,鱼油提取率降低。综上所述,选择最佳液固比为1∶1 (g∶g)。

图5 不同液固比对鱼油提取率的影响Fig.5 Effect of different liquid-solid ratios on extraction rate of fish oil

2.7 响应面优化实验

根据表1的设计进行三因素三水平的响应面优化实验,以鲣鱼内脏鱼油提取率为考察指标,所得实验结果见表3，所得回归方程为:

表3 响应面实验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiment

Y=56.20+3.79A-0.78B+1.15C-1.59AB-1.02AC+3.15BC-3.76A2-4.68B2-6.43C2。

由表4可知,模型p值为0.0015,极显著(p<0.01);失拟项p=0.5832,不显著(p>0.05),说明该模型为回归显著型,相关系数为0.9865,说明拟合性高。根据p值可以看出,三个影响因子对鱼油提取率影响的排序:酶添加量>液固比>pH,A、A2、B2、C2的作用极显著(p<0.01),BC的作用显著(p<0.05)。

表4 方差分析结果Table 4 Analysis of variance

基于模拟方差分析,图6～图8是根据软件对各因素之间的交互作用进行响应面分析得到的等高线和三维图。图6表示不考虑液固比时,酶添加量和酶解pH交互影响鱼油提取率的响应曲面图和等高线图。由图6可知,响应面的坡度不是很陡,酶添加量和酶解pH交互作用对鱼油提取率的影响不显著;与酶解pH相比,不同水平酶添加量对鱼油提取率的影响较大。

图6 酶添加量和pH的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour map of enzyme addition amount and pH value

图8 pH和液固比的响应面图和等高线图Fig.8 Response surface and contour map of pH and liquid/solid ratio

图7为不考虑pH影响时,不同水平酶添加量和液固比影响鱼油提取率的响应面图和等高线图。在酶添加量一定的条件下,鱼油提取率随液固比的增大而提高;当达到一定值时,鱼油提取率又会随液固比的增大而降低。而液固比一定时,鱼油提取率随酶添加量的增加,先增后减。

针对数字化发展的趋势，德国木工机械制造商协会总经理Bernhard Dirr博士表示，德国机械设备制造业联合会和欧洲木材加工机械制造商联合会目前正基于OPC UA（开放式平台通信统一架构），制定相关标准。这将为现代木材加工注入新动力，现在，该领域诸多细分市场已大范围实现技术成熟。即使是规模较小的工厂，也能全面掌控智能化发展趋势，轻松接入国际网络，化身具备高度灵活性的小型工厂。

图7 酶添加量和液固比的响应面图和等高线图Fig.7 Response profile and contour map of enzyme dosage and liquid/solid ratio

由图8可知,液固比和pH对响应曲线影响相对较大,而不同pH对加酶量的响应曲线最高值影响比较小。从等高线图可知,整个图形呈近椭圆形,两者之间的交互作用显著。

2.8 最佳提取条件预测及验证

经响应面优化后,得到最优参数为酶添加量2.13%,pH8.41,液固比1∶1,此时鱼油提取率的理论值为57.293%,为了方便实际操作,选取鱼油提取率的最佳工艺参数条件为:加酶量2.0%、pH8.40、液固比1∶1,在此条件下进行三次平行验证试验,实际所得鱼油提取率的平均值为58.49%±0.45%,接近于理论鱼油提取率。因此,响应面法优化得到的最佳工艺参数可靠性较高。

3 结论

以鲣鱼内脏为研究对象,用不同种类蛋白酶对鲣鱼内脏中鱼油进行生物酶法提取,结果表明,碱性蛋白酶提取鱼油的效果最佳,提取率达到57.46%。通过单因素及响应面试验对碱性蛋白酶酶解条件进行优化,得出鲣鱼内脏鱼油pH8.40、酶解时间5.5 h、酶解温度55 ℃、液固比1∶1、酶添加量2.0%的条件下鱼油提取率达到最高58.49%±0.45%。蒸煮法结合低温-钾盐乙醇法提取鲣鱼内脏鱼油的提取率为24%[26],两者相差35.49%。这表明酶解法的提取率高于蒸煮法结合低温-钾盐乙醇法,并且酶解法条件温和,有利于保护鱼油的功能性成分。研究结果为鲣鱼加工下脚料的综合利用提供理论指导。