一种天灸发泡大鼠模型的建立与评价

肖双凯,张江松,焦俊玥,赵逸彬,林咸明



一种天灸发泡大鼠模型的建立与评价

肖双凯,张江松,焦俊玥,赵逸彬,林咸明

(浙江中医药大学,杭州 310053)

探索一种稳定的天灸发泡大鼠模型的制作方法。将8只雄性SD大鼠麻醉、脱毛,称取0.018 g棉球填充于PU防水空白膏药贴中央。吸取200mL 5%斑蝥酊均匀浸湿棉球后贴敷刺激,2 h后加200mL斑蝥酊1次,密封覆盖,4 h后统一收集泡液。通过观察发泡率、泡体大小、泡液量、泡液吸收情况、发泡区域结痂情况、大鼠死亡率情况以及发泡液内总细胞数量,对本方法进行评价。200mL 5%的斑蝥酊发泡率高,泡液量和泡体大小较理想,大鼠死亡率低。用200mL 5%的斑蝥酊可以在大鼠皮肤进行稳定发泡,且操作便捷,大鼠死亡率低。

发泡疗法;天灸;斑蝥酊;模型,大鼠;灸法

天灸,也称发泡灸,是采用刺激性较强的中药贴敷在皮肤特定穴位,使局部发热、充血、发红、发泡甚至化脓的一种外治方法[1]。本法具有调节免疫的作用。目前,国内外关于天灸的研究,多建立在以人为对象的临床和实验研究[2]。在动物实验研究方面,以白芥子或斑蝥穴位贴敷至皮肤充血发红来研究血清居多[3-4],鲜见大鼠天灸泡液成分和局部皮肤病理改变的研究,这与缺乏稳定的大鼠天灸发泡模型有关。模型的建立对天灸的临床发展和机制研究必不可少[5]。为解决这一问题,本实验选择Sprague-Dawley(SD)大鼠,对传统的大鼠天灸方法进行了改进和比较研究,探索出一种稳定的大鼠天灸方法,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用健康雄性清洁级SD大鼠,体质量为(250±10)g,购自浙江省实验动物中心[许可证号SCXK(浙)2014- 0001],由浙江中医药大学实验动物中心饲养。

1.2 材料与试剂

5 cm×5 cm内圈1 cm新型PU防水空白膏药贴、PU防水膜(连云港三瑞医疗器械制造有限公司);斑蝥粉(华东医药公司,批号100722);薇婷脱毛膏(利洁时家化有限公司);95%乙醇(上海展云化工有限公司);双圈定性滤纸(杭州沃华滤纸有限公司)。

1.3 发泡方法

①5%斑蝥酊的配制,将5 g生药斑蝥粉浸泡在95%乙醇中,定容至100 mL,7 d后过滤,4℃保存;②大鼠发泡区域的备皮,大鼠腹腔麻醉后,于项部两耳后脊柱两旁等距离、等面积用薇婷脱毛膏脱毛4 cm2,用生理盐水清洁后在大鼠恒温台上安置,室温控制在26℃;③发泡药贴的准备,称取0.018 g棉球填充于发泡药贴的中央,轻轻按压,以棉球刚好填充满且不高突于发泡药贴的中心圈为度。

1.4 PU防水膜棉球压充法

上述准备工作完成后,吸取200mL 5%斑蝥酊均匀浸湿棉球后,贴敷于大鼠待发泡区域。发泡药贴四周贴膜应当均匀,防止药物挥发。2 h后加200mL斑蝥酊1次,密封覆盖。用PU防水膜密封并继续观察2 h,并于4 h时统一收集泡液。操作者小心从中间区域剪下PU防水膜,用镊子夹出棉球并沿着发泡药贴的内侧缘小心提起,观察发泡情况。剪掉其余发泡药贴的中心圈,保留其周围与大鼠皮肤黏合的部分,以防止发泡区域及周围皮肤表皮层因发泡后疏松而意外脱落,泡液流失。室温放置,游标卡尺测量泡体的长短轴大小。详见图1A。

1.5 观察指标

1.5.1 一般情况观察

观察并记录大鼠发泡前后活动反应能力、毛发情况、精神状况、排便和日常行动等一般状况。

1.5.2 记录发泡率和大小

4 h后统一取下发泡药贴,立即记录发泡数量,并测量泡体大小。泡体大小由游标卡尺测量长短轴,计算出泡体皮肤接触面的面积(精确到0.1 cm2)。圆面积公式为S=p(圆周率)×r²,其中π表示圆周率,r表示半径;椭圆面积公式为S=p×a×b,其中a、b分别是椭圆的半长轴和半短轴的长。

1.5.3 观察泡液量

用量程为20～200mL的移液枪小心抽取泡液,并保存在EP管中,记录每只大鼠泡液量。

1.5.4 记录泡液总细胞数量

泡液收集后用血球计数盘来计数泡液中总细胞数量,并进行统计。

1.5.5 大鼠存活率

发泡后,持续观察大鼠1周,如有死亡则立即记录死亡时间。

1.5.6 观察发泡区域皮肤变化状况

发泡后大鼠单笼饲养,1周内持续观察,如有结痂、溃烂、红肿和感染等情况,应详细记录时间。

2 结果

2.1 大鼠天灸前后一般情况变化

天灸前,大鼠皮毛均光泽顺滑,精神状态佳,行动敏捷,体质量稳定增长、粪尿正常。天灸后,直到24 h泡液完全吸收之间,大鼠狂躁多动,四处攀爬,瘙抓发泡区域。泡液完全吸收至3 d内,上述情况逐渐改善,但体重增长十分缓慢,部分大鼠出现体质量下降,饮食减少,并表现为竖毛、杂乱,毛色失去光泽。大鼠精神差,活动减少,行动迟缓。第4天开始,上述情况逐渐恢复,一直到第7天,大鼠各项生理状况基本恢复至天灸前。

2.2 大鼠发泡率和存活率情况

8只大鼠贴敷4 h后成功发泡7只,发泡率为87.5%。7 d后,8只大鼠均存活,存活率为100%。详见表1。

2.3 泡体大小情况

通过对泡体的测量,发现各大鼠发泡大小差异性大,最小可如米粒般,最大可以充满整个发泡药贴的空间,尚不能人为控制。详见表1、图1B。

2.4 泡液量情况

在已发泡的7只大鼠中,有5只可以成功抽取泡液,最大泡液量为200mL,其泡体的大小和泡液量基本呈现正相关。详见表1。

2.5 泡液总细胞数量情况

泡液收集后进行统一稀释,用血球计数盘计数,发现泡液总细胞数基本相同,为5×106/mL,并且镜下细胞数量密集。

2.6 发泡区域皮肤变化状况

经观察,发泡区域皮肤主要出现结痂情况,伴随着红肿的出现,无溃烂和感染。大鼠结痂伴随着发泡的出现而出现,不发泡大鼠没有出现结痂情况。从48 h开始,逐渐开始有结痂出现;第3天(72 h前后)均有不同程度的结痂,痂块中心区域颜色暗红,周围淡红并稍透明;5 d后大部分脱落;7 d后基本完全脱离。脱落后,大鼠发泡区域皮肤逐渐恢复正常,开始有部分新生毛发。详见图1C。

天灸对不同发泡时长的大鼠皮肤组织结构和炎性细胞浸润均有直接影响,突出表现在①正常大鼠皮肤组织结构完整,表皮层次、基底层、棘层以及颗粒细胞层的构成和排列都清晰,连续且完好。详见图1D。②当天灸刺激,水泡出现时,经HE染色观察到皮肤颗粒层增厚(见图1Ea);棘层松解,棘细胞间水肿(见图1Eb);基底层细胞变性,柱状上皮细胞变性,形态改变(见图1Ec);炎性细胞浸润以嗜酸性粒细胞为主,开始浸润(见图1Ed)。③当水泡消失,发泡区域结痂后,发现表皮脱落,棘层、颗粒层和基底层细胞均缺失,痂块出现(见图1Fa);嗜酸性粒细胞大量浸润(见图1Fb)。

表1 5%斑蝥酊大鼠发泡情况

3 讨论

目前从国内外文献来看,天灸的发泡方法多以白芥子配合其他刺激性药物共同研末成药饼贴敷穴位[6],或以白芥子、斑蝥单独贴敷发泡[7],国内也有用斑蝥末和凡士林制成斑蝥膏发泡[8];国外研究则多以斑蝥素发泡为主[9-11],或用负压拔罐的方法在人前臂进行发泡研究[12]。以上研究均是以人为对象进行天灸发泡,且发泡稳定,在此基础上的许多研究有力地推动了传统天灸疗法的发展。但动物实验研究方面尚未见到详细的天灸发泡方法,有报道用不同浓度的斑蝥酊刺激大鼠皮肤,但仍难以看到水泡[13],这和动物与人皮肤的差异性、发泡方法、发泡药物和发泡材料的选择等诸多因素有关,也在一定程度上限制了天灸的动物实验研究。

本实验通过对以上天灸方法进行总结、对比[8],经过前期大量预实验,最终选择用斑蝥酊发泡,并筛选出了斑蝥酊发泡的最佳浓度和独特方法,可以实现稳定发泡,具有很大优势。在发泡材料的选择方面,本课题组认为大鼠发泡关键在于持续的皮肤刺激,药物的刺激只是一个方面,且只有在药物与皮肤接触面有较充足的空间时才能发泡。否则,泡液将会渗透入疏松的皮肤表皮层而难以见到泡体。故本实验用浸湿的棉团作为填充材料,这样既实现了斑蝥酊的持续性刺激作用,又保证了充足的空间,这是发泡的关键因素。对于重复加药方法的确定,笔者发现单次给于斑蝥酊并不能发泡,这可能是由于斑蝥酊经过皮肤渗透逐渐吸收之后,发泡药贴中剩余斑蝥酊剂量不足,不能起到持续性的皮肤表面刺激。故笔者经过进一步尝试,在2 h时加药1次,保证了持续性的药物刺激,最终获得了稳定的发泡。

在天灸发泡的评价指标方面,因本实验是以大鼠为对象进行的发泡,在此之前,国内外文献均无明确、详细的实验性大鼠天灸发泡的报道,故并无有针对性的详细分类和判定标准。但笔者通过参考借鉴相关临床研究[7],初步拟定了以大鼠为研究对象天灸发泡的评价指标,即以发泡率、泡体与皮肤接触面积、泡液量、泡液吸收情况、发泡区域结痂情况、死亡率情况以及泡液总细胞数量,对本天灸发泡方法进行评价,切合临床,具有评价意义。在发泡液内总细胞数量的计算方面,笔者发现天灸泡液中有大量细胞募集,总数量约为5×106/mL,并且发泡液最大收集的总体积可达到2 mL,这就对今后大鼠天灸发泡液内细胞以及相关因子的研究提供了可能。

另外,本课题组的另一项实验通过对天灸敷药后(4 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h)发泡区域皮肤组织病理学和泡液的观察,发现皮肤不仅棘层有不同程度的肥厚和松解,而且基底层细胞也均有变性或缺失(HE染色,见图E、F)。通过查阅相关文献,笔者发现在天灸发泡的过程中,棘层的松解起到了关键性作用[14-15]。在天灸发泡液的研究方面,邹晓军等[16]研究发现,发泡液中大部分是中性粒细胞、巨噬细胞及树突状细胞(DC),而且发泡液的DC是外周血DC的3～10倍,斑蝥的发泡作用可以局部聚集DC并促进其成熟和分化,从而达到免疫调节作用。天灸可以调节免疫,本课题组也在前期预实验中已证实天灸发泡的性质是一种炎性刺激,还兼有疼痛刺激的成分,这两个因素相互协同,相互存在。故笔者认为通过天灸发泡,炎性刺激和免疫调节均发挥作用,并且这种免疫炎症反应可能主要通过DC来实现,但还需要进一步进行验证。

斑蝥酊中发泡成分以斑蝥素为主,国外研究发现人为对象可用斑蝥素进行皮肤发泡[17-19],但笔者预实验中用斑蝥素代替斑蝥酊,反而在大鼠皮肤没有出现发泡的效果,这可能与人和大鼠皮肤的差异性有关。故笔者认为很可能是以斑蝥素为主的成分刺激了皮肤从而导致发泡的效果,但并不单纯是斑蝥素这单一成分。斑蝥素确有肝肾毒性,经查阅相关文献后,笔者发现近年来斑蝥素肝肾毒性的研究多以小鼠为对象进行,大鼠报道则较少,主要有腹腔注射、灌胃、膀胱灌注和直接经直肠给药等方式[20-23]。通过参考其使用剂量,笔者发现,无论是选择斑蝥素半数致死量(LD50,1.86 mg/kg)或斑蝥粉0.05 g/穴刺激,均对肝脏或肾脏有损伤,如邹建军等[20]研究发现斑蝥素腹腔注射后对小鼠肝、肾有明显的毒性作用,其中5 h左右肝损害最严重,3 h左右肾脏损害最严重,并且其毒性随给药量增加而增强。刘文吉[23]通过斑蝥粉0.05 g/穴刺激,观察天灸对大鼠肝纤维化的防治效应,发现天灸组与正常组相比,其血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平均有不同程度的增高。故笔者认为,斑蝥酊天灸发泡是一种以斑蝥素为主要成分的发泡刺激,它可以对大鼠肝肾造成一定的损伤,这考虑是造模本身对动物的不良反应。但结合上述文献记载,笔者认为无论是参考小鼠或大鼠斑蝥的用量情况,本实验中选择5%的斑蝥酊浓度是在安全剂量以内。

斑蝥属于有毒的刺激性药物,故在实验中应当严格佩戴口罩和手套,以防止呼吸道和皮肤的损伤[24-25]。在泡液收集的过程中,笔者还发现部分泡体出现了面积大但泡液少的情况,这可能和泡体表皮层疏松、泡液向周围渗漏有关,故泡液应当及时收集,需避免大鼠过多的剧烈活动。最后,本方法也存在一定的不足之处,首先是大鼠发泡的位置不规律,尚难集中在中心区域发泡,边缘区域发泡亦多见;其次,泡体形状不可人为控制;再次,泡体大小差异性大。这些都需要进一步探索。

综上所述,本实验成功实现了SD大鼠的天灸发泡,在一定程度上复制了人体天灸的过程,模拟了临床应用天灸的诸多特征。该模型的建立可以为天灸的实验研究提供一定的实验基础和模型参考[26]。今后本课题组将会在此基础上进行继续尝试和改进,以期实现大鼠发泡位置、大小和泡体形状的人为可控性,并且基于此模型基础上的动物天灸泡液成分以及天灸机制的实验研究也将会是新的方向。

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Establishment and Evaluation of a Rat Model of Formation of Blisters in Vesiculation Moxibustion

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,310053,

To explore a stable method to establish a rat model of formation of blisters in vesiculation moxibustion.Eight male Sprague-Dawley (SD) rats were anesthetized and depilated. 0.018 g cotton balls were filled in the center of the PU waterproof blank paste plaster.5% cantharides tincture 200mL was drawn to soak the cotton ball evenly and then was applied. Two hours later, 200mL cantharides tincture was added once and then it was sealed. The blister fluid was collected 4 h later. This method was evaluated by observing the formation rate of blisters, the size of blister, the volume of blister fluid, the absorption of blister fluid, the scab in the area of blisters, the mortality rate of rats and the total number of cells in blister fluid.The formation rate of blisters with application of 5% cantharides tincture 200mL was high, the volume of blister fluid and the size of blister were more ideal, and the mortality rate of rats was low.The stable formation of blisters on the skin of rats can be achieved with application of 5% cantharides tincture 200mL. The operation is convenient and the mortality rate of rats is low.

Blistering therapy; Vesiculation moxibustion; Cantharides tincture; Model, Rats; Moxibustion

1005-0957(2019)13-0055-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.13.0055

2018-11-03

“十三五”浙江省中医药(中西医结合)重点学科建设计划(2017-XK-A18)

肖双凯(1989—),男,2015级硕士生,Email:379691025@qq.com

林咸明(1966—),男,教授,Email:linxianming66@126.com