苦荞抗氧化性与生长条件的相关性

国旭丹 王超楠 张 婧 吴兰芳

(河北中医学院基础医学院1，石家庄 050200) (河北中医学院药学院2，石家庄 050200)

苦荞(FagopyrumtatariumGaertn.)含有丰富的酚类物质尤其是黄酮类成分，如芦丁和槲皮素含量和活性极为突出。实验研究和流行病学研究表明苦荞黄酮在控制体重、降低血糖、血脂、血压水平，抑制动脉粥样硬化发生和改善血管功能等方面的有益作用[4]。抗氧化性是苦荞发挥以上保健功能作用的基础。研究发现生长地点、环境因素、生长季节及品种会影响荞麦的品质指标，但气象因子是影响荞麦综合品质指标的最重要、最活跃的因子[5]，而气象因子对苦荞抗氧化性差异的贡献大小却鲜见报道。

本研究以在3个不同环境条件下生长的2个品种的苦荞为原料，通过提取苦荞全粉中的游离酚和结合酚，并在不同的抗氧化体系考察它们的体外抗氧化性，以HPLC测定芦丁和槲皮素的含量，进而定量分析品种、环境条件及其交互作用对以上指标差异贡献的大小，在此基础上分析以上指标和生长环境的相关性。以期初步探讨通过选择优化特定品种和生长条件培育出具有更强抗氧化性的苦荞具有可能性。本研究结果为苦荞的育种、生产和消费提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采集生长在四川凉山、宁夏同心和甘肃定西的兴苦2号与迪庆苦荞种子，3个地区的环境条件如表1。

表1 3个苦荞生长地的环境条件

DPPH·、ABTS、Trolox、β-胡萝卜素、Tween-40、芦丁、槲皮素标品(色谱级)。

1.2 仪器与设备

ESB-300实验室乳化机； UV1240紫外可见分光光度计；FW100型高速万能粉碎机；高效液相色谱仪：SPD-M10A VP Shimadzu, LC-8A pump。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理：

采用万能粉碎机将苦荞种子粉碎，时间约30 s，过40目筛，弃苦荞壳，得苦荞全粉。

1.3.2 水分的测定

将苦荞种子97 ℃干燥16 h后，放入干燥器中冷却，称重，再干燥、冷却、称重，直至恒重，测得苦荞种子的含水量。

1.3.3 游离酚的提取

1 g苦荞全粉用50 mL 80%丙酮均质10 min，1 500 r/min离心10 min，取上清。此步骤重复操作3次。收集3次上清液，于45 ℃蒸干，甲醇定容至10 mL，即为游离酚提取物。-20 ℃避光储存[6]。

1.3.4 结合酚的提取

1 g苦荞全粉以50 mL 80%丙酮均质10 min，1 500 r/min离心10 min，弃上清。沉淀部分加入20 mL 2 mol/L NaOH，充氮气，摇床上消化1 h，以4 mL浓盐酸调至中性，20 mL正己烷去脂后，20 mL乙酸乙酯提取，离心后取上清，乙酸乙酯提取5次，合并上清45 ℃旋转蒸干。甲醇定容至10 mL，即为结合酚提取物。-20 ℃避光储存[6]。

1.3.5 DPPH·的清除能力

1 mL提取液与1 mL 131.87 μmol/L DPPH·溶液混匀后室温下避光放置30 min， 517 nm处测吸光值。结果以μmol Trolox/100 g DW表示[7]。做3次重复。

1.3.6 ABTS·+的清除能力

5 mol/L ABTS溶液与二氧化锰室温下放置30 min，过滤除去二氧化锰，734 nm下以pH 7.4的磷酸缓冲液将该溶液吸光值调至0.7得稳定的ABTS·+溶液。3 mL ABTS·+溶液与200 μL稀释一定倍数的提取液反应，734 nm下测其吸收值，3 mL ABTS·+溶液与200 μL蒸馏水作对照。结果以mmol Trolox/100 gDW表示[8]。做3次重复。

1.3.7 β-胡萝卜素-亚油酸乳化液法

参照文献[9]的方法。抗氧化系数(AAC)的计算公式为：

式中：As(60)为样品管60 min时的吸光值；Ac(60)为对照管60 min时的吸光值；Ac(0)为对照管0 min时的吸光值。

1.3.8 芦丁和槲皮素含量的测定

上清液经0.45 μm过滤，Phenomenex C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相0.4%磷酸-甲醇(体积比40∶60)，流速1.0 mL/min，柱温20 ℃，检测波长358 nm，进样量100 μL。标准曲线法定量，结果以mg/100 g DW表示。

1.3.9 数据处理

方差分析和显著性检验用SPSS软件处理。

2 结果与分析

2.1 苦荞全粉的抗氧化作用

2.1.1 DPPH·清除能力

由图1可知，游离酚和结合酚提取液均表现出了较强的DPPH·清除能力，清除能力范围分别是(22 931.81±496.80)～(33 403.68±393.55) μmol Trolox/100 g DW和(66.16±1.11)～(245.82±14.01) μmol Trolox/100 g DW，显然游离酚提取物远远高于结合酚提取物的DPPH·清除能力，这是由于苦荞全粉中的抗氧化成分大多以游离形式存在。由图1还可看出，不同样品表现出了不同的DPPH·清除能力，这可能是由于苦荞生长的环境条件和品种的影响。例如，对于兴苦2号品种，3个地区生长的苦荞全粉的结合酚提取物对DPPH·的清除能力有显著差异。对于迪庆品种，在四川生长的苦荞全粉的游离酚和结合酚提取物的DPPH·的清除能力都明显高于在宁夏和甘肃生长的。不同品种的苦荞在相同地域如宁夏和甘肃地区生长时其对DPPH·的清除能力也具有显著不同。

注：字母不同表示差异在P<0.05水平显著，余同。图1 苦荞提取物的DPPH·的清除能力

2.1.2 ABTS·+清除能力

由图2可知，游离酚和结合酚提取液均表现出较强的ABTS·+清除能力，清除能力范围分别是(123.30±0.85)～(139.17±11.17)mmol Trolox/100 g DW和(0.42±0.04)～(1.01±0.10)mmol Trolox/100 g DW，显然游离酚提取物仍远高于结合酚提取物的ABTS·+清除能力。虽然不同品种和不同环境条件下生长的苦荞全粉游离酚提取物对ABTS·+的清除能力都没有显著差异，但它们的结合酚提取物之间的差异显著。

图2 苦荞提取物的ABTS·+的清除能力

2.1.3 抑制β-胡萝卜素褪色的能力

由图3可知，尽管游离酚提取物部分被稀释了一定倍数，游离酚提取液仍表现出了较强的抑制β-胡萝卜素褪色的能力，其抗氧化系数范围是(518.17±15.45)～(701.47±21.56)，结合酚提取液的抗氧化系数范围是(178.88±8.30)～(498.82±56.74)。在抑制β-胡萝卜素褪色的能力上，相同品种不同地区生长的苦荞全粉游离酚或结合酚提取物具有显著差异；相同环境条件生长的不同品种的苦荞全粉游离酚或结合酚提取物也具有显著差异。

注：同一抗氧化系数下，自由酚被稀释了6倍。图3 苦荞提取物的抗氧化系数

2.2 芦丁和槲皮素含量

由表2可知，苦荞全粉中以游离形式存在的芦丁和槲皮素含量远远高于以结合形式存在的芦丁和槲皮素，说明苦荞全粉中的芦丁和槲皮素主要以游离形式存在。芦丁和槲皮素含量分别是(518.54±4.32)～(1 447.87±1.69) mg/100 g DW和(425.65±4.03)～(857.62±3.66) mg/100 g DW。6个样品的芦丁含量都有显著差异，除甘肃地区2个品种的槲皮素含量没有显著差异外，宁夏和四川的槲皮素含量均有显著差异，表明生长条件或品种或者它们的相互作用都可能影响苦荞全粉中芦丁和槲皮素的含量。

表2 苦荞全粉中的芦丁和槲皮素含量/mg/100 g DW

2.3 品种和环境对苦荞抗氧化性的影响

本实验中2个品种3个生长地区的苦荞全粉在不同的抗氧化体系中表现出了显著差异，说明品种和环境对苦荞抗氧化性有较大影响。为了分离并定量品种、环境和品种×环境(品种和环境交互作用)对苦荞抗氧化性的影响，基于3个地区2个苦荞品种的数据设计了一个2×3因子的ANOVA分析。品种、环境和品种×环境方差贡献率(总均方的百分比)的大小可以指出它们对苦荞抗氧化性影响的相对重要性。方差贡献率见表3。结果表明品种、环境和品种×环境都极显著影响着苦荞的DPPH·清除能力，芦丁和槲皮素含量(P<0.01)。而对于抗氧化系数，环境对游离酚提取物总方差表现出了较高的贡献率，达77.36%(P<0.01)，而品种×环境对结合酚提取物总方差表现出了较高的贡献率，达77.11%(P<0.01)。总的来说，对于抗氧化性，环境贡献率(范围为40%～77%)高于品种和品种×环境的贡献率(分别为31%～33%和20%～77%)；对于芦丁和槲皮素含量，环境的贡献率也高于品种和品种×环境。说明环境对抗氧化性、芦丁和槲皮素含量的影响较品种和品种×环境大。

表3 品种、环境及交互作用对苦荞抗氧化性影响的比例

注：结果以总均方的百分比表示；*表示显著(P<0.05)，**表示极显著(P<0.01)，n代表没有贡献。

2.4 抗氧化作用和生长条件的关系

由2.3结果分析得到对苦荞粉的抗氧化性的影响因素中生长环境是最重要因素。所以，重点分析了环境参数包括平均气温、降水量、日照时间和海拔对苦荞抗氧化性的影响，苦荞粉抗氧化性与环境参数的相关性分析结果见表4。结果显示，海拔与芦丁含量在2个品种中都表现出了显著的正相关性(r=0.98，P<0.05)。对于兴苦2号品种，总DPPH·清除能力与海拔有显著的正相关性(r=0.99，P<0.05)，游离酚提取物抑制β-胡萝卜素褪色的能力与降水量有显著的正相关性(r=0.98，P<0.05)。对于迪庆品种，结合酚提取物抑制β-胡萝卜素褪色的能力(r=0.99，P<0.05)和槲皮素含量(r=0.96，P<0.05)与日照时间有显著的正相关性。

表4 苦荞抗氧化性与生长条件的相关性分析

注：结果以Pearson相关系数表示；*表示显著(P<0.05)； DPPH代表DPPH·的清除能力， AACF代表游离酚提取物的抗氧化系数，AACB代表结合酚提取物的抗氧化系数。

3 讨论

在3种抗氧化体系中，苦荞表现出了很强的DPPH·和ABTS·+的清除能力及抑制β-胡萝卜素褪色的能力(图1～图3)。DPPH·和ABTS·+的清除能力分别为2.3×104～3.3×104μmol Trolox eq./100 g DW和1.2×105～1.4×105μmol Trolox eq./100 g DW，显然，苦荞的自由基清除能力高于小麦(ABTS·+清除能力为14.3～17.6 μmol Trolox /g DW))[10]、强化的胡萝卜(DPPH·的清除能力为6.21～ 131.1μmol Trolox/g DW、ABTS·+的清除能力为10.1～285.0μmol Trolox/g DW)[11]，暗示苦荞可以作为清除自由基的良好膳食来源。在抑制β-胡萝卜素褪色方面，苦荞游离酚提取物的AAC为518～701，结合酚提取物的AAC为178～501(图3)，与甜荞籽、小麦胚芽、向日葵籽以及公认的强抗氧化性的蓝莓(抗氧化系数分别为125、236、298和796)[12]相比，苦荞的AAC较高，暗示在抑制β-胡萝卜素褪色方面苦荞同样具有较高的有效性。

从图1～图3可看出，游离酚提取物的自由基清除能力远远强于结合酚提取物。平均来说，游离酚提取物对总自由基清除能力的贡献大于99%。因此，可以认为游离酚提取物是总自由基清除能力的主要贡献者。苦荞在食品及医药领域已广受关注，黄酮成分是其功能性开发基础，芦丁和槲皮素是其中含量最为丰富，活性最为突出的黄酮化合物。本研究中苦荞粉以游离形式存在的芦丁和槲皮素含量远远高于以结合形式存在的芦丁和槲皮素，说明苦荞全粉中的芦丁和槲皮素主要以游离形式存在。由于游离酚和结合酚分别在人体的上消化道和结肠被吸收发挥它们对机体健康的保护作用，所以苦荞粉通过上消化道被吸收发挥保健功能的作用更大。

由图1～图3和表2可知， 在3个地区生长的2个品种的苦荞全粉在抗氧化性、芦丁和槲皮素的含量上均表现出了显著差异，说明品种和环境对它们有较大影响。本研究进而定量分析了品种、环境条件及其交互作用对以上指标差异贡献的大小。环境贡献率最大，其次是品种×环境，品种的贡献率最低。发现日照时间、降水量、海拔与苦荞全粉的抗氧化性、芦丁和槲皮素含量有显著的正相关性，平均气温与槲皮素含量有显著的负相关性，文献[5]指出荞麦整个生育期降水有利于荞麦品质指标的积累，充足的光照有利于作物生长，也利于各品质指标积累。较高的均温和日最高温大于30 ℃时，对荞麦的生长有不良影响，不利于各品质指标的积累，以上报道支持本研究结果。芦丁含量和生长地的海拔高度在2个品种中表现出了一致的结果，说明苦荞全粉的芦丁含量与其生长地的海拔有显著的相关性。文献[13]发现环境条件比品种更能影响苦荞药草的芦丁含量，而且苦荞叶中的芦丁含量受UV-B照射和干燥处理的影响[14]。以上说明海拔越高，紫外线越强，越有利于芦丁的产生。所以在高海拔地区种植苦荞有利于芦丁含量的积累。

4 结论

本研究结果指出环境对苦荞全粉抗氧化性、芦丁和槲皮素含量总方差的贡献率最大，其次是品种×环境，品种的贡献率最低。环境参数如高海拔有助于提高苦荞芦丁含量(r=0.98，P<0.05)，日照时间与槲皮素有显著的正相关性(r=0.98，P<0.05)，海拔、降水量和日照时间与苦荞全粉的抗氧化性有显著的正相关性(r≥0.98，P<0.05)。该结果提示通过优化特定苦荞品种的生长条件便可能培育出富含天然抗氧化剂的苦荞。