一株青刺果内生真菌的分离鉴定及抑菌试验

杨嫦丽，郑 鹏

(丽江师范高等专科学校，云南丽江 674100)

内生菌(endophyte)指的是一类其生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物体内的，但对宿主植物不会引起明显的病害症状的微生物[1]，普遍存在于植物各种组织中。最早在1993年由Stierle从红豆杉中分离到一株能产生紫杉醇的内生真菌，并发现内生菌可以产生与宿主植物相同或相似的活性成分[2]，此后，植物内生菌的研究在国内外掀起热潮，特别对药用植物内生菌的研究成为一大热点，据统计，已经开展内生菌研究的药用植物有40多科100多种[3]，对药用植物内生菌应用的分析和开发提出了可能性。大量研究表明，植物内生菌除了能产生与宿主植物相同功能的生物活性之外，某些药用植物的内生菌还能够独立产生如抗生素之类的丰富次级代谢产物[4]。植物内生菌种类较多，包括内生细菌、内生真菌、内生放线菌，其生物学功能也比较丰富。内生菌与宿主植物协同进化，通常与宿主的生物学功能有一定的关联[5]，所以植物内生菌的研究对其宿主植物的选择也尤其重要。

青刺果(PrinsepiautilisRoyle)，为蔷薇科扁核木属(Pdnsepia)多年生的一种常绿灌木[6]，在我国主要分布于高原地区，在丽江主要分布于海拔2 300～3 200 m的高寒冷凉山区；用途广泛，全身具有较高的营养和药用价值，其茎、叶、果、根均可入药，在云南，少数民族具有上千年的民间药用、食用历史。青刺果中分离的化合物具有动物红细胞和淋巴细胞免疫功能，能提高机体免疫以及降血糖和降血脂[6-7]，其提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、志贺菌和白色念珠菌等细菌、真菌具有较好的抑菌效果[8-13]。目前国内外对青刺果的化学成分和营养价值研究较广泛，但对青刺果内生菌的研究报道较少[14]。笔者从青刺果中分离得到内生真菌3B-S，对其进行分类鉴定和抑菌检测试验，初步研究3B-S的抗菌作用，为后期青刺果与内生菌活性成分的研究以及植物内生菌的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1供试材料供试青刺果(PrinsepiautilisRoyle)采自丽江金山乡新团片区田间。供试菌株胶胞炭疽病菌和尖孢镰刀菌古巴专化型病菌为丽江师范高等专科学校生物实验室保藏。培养基为PDA培养基。

1.2试验方法

1.2.1内生真菌3B-S的分离。取青刺果健康茎段表面冲洗干净，晾干后蒸馏水冲洗3次，切成3 cm左右的小段浸泡于75%乙醇中30 s，再用无菌水冲洗数次，无菌滤纸吸干水分，切掉小茎段两端露出新组织，再切成两半接种于PDA平板，28 ℃暗培养14 d。待植物组织上有菌丝长出后，挑取菌丝于PDA培养基平板划线分离纯化，保存单菌落备用。

1.2.2内生真菌3B-S的鉴定。

1.2.2.1菌落特征观察。用灭菌的打孔器对保存好的菌落进行打孔，菌饼放置于PDA培养基平板中央，于28 ℃培养7 d并观察菌落特征。

1.2.2.2形态特征观察。取打孔后的菌饼置于PDA平板中央，用插片法，用灭菌后的镊子将4块无菌盖玻片竖直插入菌饼四周，于28 ℃培养，待菌丝长到盖玻片上后，轻取出，用火焰稍加热固定后棉兰染色液染后，加工做成装片，于光学显微镜下观察形态。

1.2.3内生真菌3B-S抑菌检测。备好用平板培养基培养好的胶胞炭疽病菌和尖孢镰刀菌古巴专化型病菌菌落、3B-S菌落，用灭过菌的打孔器分别对3B-S和2个病原菌进行打孔。取3B-S菌饼接种到PDA平板培养基中央，尖孢镰刀菌古巴专化型病菌菌饼接种于3B-S菌饼左边，胶胞炭疽病菌饼接种在右边，放于28 ℃恒温中培养7 d进行对峙检测，观察抑菌情况。3个菌饼距离2 cm左右。

2 结果与分析

2.13B-S的分离和形态特征从青刺果茎段中成功分离得到内生真菌3B-S，纯化培养成菌落，从图1可观察发现，内生真菌3B-S菌株呈丝状，菌落最初灰白色，随着培养时间逐渐长成黑色。菌丝体在平板上埋生或气生，由菌饼向四周均匀生长，生长迅速，背面黑色。菌丝光滑，有隔多分支，分生孢子梗单身，分生孢子梗顶端膨大为瓶状(图2)。分生孢子单身，刚形成时半透明，成熟的分生孢子黑色，球形或扁球形。根据青刺果内生真菌3B-S的形态学特征，参照真菌分类鉴定方法、参考张敬泽等[15]研究，初步确定该菌为黑孢菌属真菌。

图1 菌株3B-S 菌落形态Fig.1 Colony morphology of strain 3B-S

图2 3B-S菌丝和分生孢子形态Fig.2 Mycelium and conidia morphology of 3B-S

2.2内生真菌3B-S的初步抑菌监测内生真菌3B-S与胶胞炭疽病菌和尖孢镰刀菌古巴专化型病菌的对峙培养发现(图3)，经过7 d培养后，内生真菌3B-S迅速生长，而胶胞炭疽病菌和尖孢镰刀菌古巴专化型病菌的生长均受到3B-S的抑制，逐渐被内生真菌3B-S菌丝覆盖，有较明显的抑菌效果，其中对胶胞炭疽病菌的抑制效果更为明显。

图3 内生真菌3B-S对尖孢镰刀菌(区域A)和炭疽病菌(区域B)的对峙检测Fig.3 Detection of endophytic bacteria 3B-S against Fusarium oxysporum(region A)and anthracnose(region B)

3 讨论

随着化学合成的部分农药、化肥、医药等对人类赖以生存的生态环境和自身饮食健康产生不同程度的负面影响，人们对生活的需求越来越重视，探索新兴的、生态绿色的代替品成为人类的重要目标。而植物内生菌被发现具有独特的遗传代谢，不仅对植物生长发育、植物抗逆性有重要的影响，还能产生抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性物质。因此，分离鉴定植物的内生菌，研究植物内生菌的抗菌活性和拮抗作用，在生物防治、医药研究、土壤改善等方面具有重要的意义和广阔的前景。

该研究通过对内生菌形态特征观察，从形态学上初步鉴定3B-S为黑孢菌属真菌，但较系统的分类鉴定还需借助分子技术进一步的rDNA系列测定及系统进化分析。目前，黑孢菌属被报道的种较为鲜见，该试验发现的黑孢菌属的分类鉴定和相关研究具有重要的意义。

抑菌检测试验中，青刺果内生真菌3B-S对胶胞炭疽病菌和尖孢镰刀菌古巴专化型病菌均有明显的抑菌效果，说明内生真菌3B-S在抑菌研究方面具有一定的研究价值。青刺果本身的药用价值有较大的开发潜力，前期已有大量研究证明青刺果化合物具有抗癌、抑菌等效果，而植物内生菌与宿主植物的生物学功能有关联，因此研究青刺果内生菌具有开发和应用价值，但对植物病菌的抑制作用还需要大量的检测，对内生菌的活性物质及与青刺果植物活性成分的关联性还需进一步分析。