DNA甲基转移酶3B-149C＞T多态性与致癌风险相关性的M e ta分析

吴 雯，李 萍，左 然，

曾庆波2，4，吴德生2，谢 妮3，

龙鼎新1，*，袁建辉1，4，5，*

(1．南华大学公共卫生学院，湖南 衡阳

421001；2．深圳市疾病预防控制中心毒理研究所，广东 深圳 518055；3．深圳市第二人民医院转化医学研究院，广东 深圳 518000；

4．中山大学公共卫生学院，广东 广州 510080；

5．深圳市南山区疾病预防控制中心，广东深圳 518054)

DNA甲基化是哺乳动物基因组中最常见的表观遗传修饰之一，是在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的催化作用下发生的共价修饰过程。已知有活性的DNMT有3种：DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，DNMT1主要负责维持性甲基化，DNMT3A和DNMT3B主要参与从头甲基化。在肿瘤组织中，可以观察到DNMT3B显著过表达，DNMT1和DNMT3A的过表达则不明显[1-2]。

DNMT3B位于人染色体20q11.2上，有23个外显子和22个内含子，其主要结构包括：高度可变的N-末端、PWWP结构域、锌结合位点及具有催化功能的C-末端[3-4]。研究报道，DNMT3B启动子区有3个多态性位点：启动子区-283T＞C(外显子1A为起始点)单核苷酸多态性、启动子区-579G＞T(外显子1B为起始点)单核苷酸多态性以及启动子区-149C＞T单核苷酸多态性(C46359T，GenBank 登录号 AL035071，rs2424913)，其中以DNMT3B-149C＞T多态性最为常见[5-7]。

近年来，各研究表明DNMT3B-149C＞T多态性可能在癌症发生中起关键作用。2002年Shen等[8]发现DNMT3B-149C＞T多态性与肺癌相关。随后DNMT3B-149C＞T多态性与乳腺癌、结直肠癌、白血病等多种肿瘤易感性相关的研究陆续发表，但迄今尚未达成共识[9-11]。本文旨在利用Meta分析的方法判断DNMT3B-149C＞T多态性和致癌风险的相关性，从而为临床实验及检测提供理论依据、为个体化治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 资料来源

通过联机检索PubMed、Ovid、Embase、Web of Science、万方数据库、维普中文科技期刊数据库及中国知网中1990年1月1日-2017年10月31日中发表的探讨DNMT3B-149C＞T多态性(rs2424913C＞T)和致癌风险相关性的文献。英文检索策略为：(“DNA methyltransferase 3B”OR“rs2424913”OR“C46359T”)AND(“cancer”OR“carcinoma”OR“tumor”)；中文检索为：(“DNA甲基转移酶3B”OR“rs2424913”OR“C46359T基因多态性”)AND(“癌”OR“瘤”)；未进行任何检索限制。

1.2 文献纳入标准

本研究的文献纳入标准为：①均为观察性研究(病例-对照研究、队列研究)，设置癌症组与对照组固定比较；②研究对象为与致癌风险相关的rs2424913C＞T多态性；③有关基因型或等位基因频率的数据资料可用于评估比值比(OR)和95%置信区间(95%CI)；④有研究开展和发表的年限。

1.3 文献排除标准

本研究的文献排除标准为：①采用Newcastle-Ottawa Scale(NOS)文献质量评价量表的质量评价标准，对每篇文献进行严格的质量评价，综合考虑研究设计质量，排除质量过低的文献[12]；②系统评价、Meta分析和其他综述类文献；③动物与尸体的研究类文献。

1.4 数据提取

由两名研究人员(吴雯和李萍)独立审查这些文献以排除不相关和重叠研究，使用NOS量表提取符合条件的研究数据。采用统一的数据收集表，用于确保数据符合上述纳入标准的准确性。比较数据收集结果，对任何不一致都进行充分讨论，以达成共识。每项纳入研究中提取的信息有：第一作者的姓氏、出版年份、受试者的种族、癌症类型、病例与对照的数量、基因分型方法及文献评分。经讨论后，最终就所有提取的信息达成了共识。

1.5 统计分析

计算每个研究的整体OR及其相应的95%CI，以评估DNMT3B-149C＞T多态性与致癌风险(纯合子基因型比较CC与TT、杂合子基因型比较CT与TT、显性遗传型比较CC+CT与TT)之间的关系。合并OR的显著性由Z检验确定，P＜0.05被认为有统计学意义。

通过Q检验和I2值评价各研究间异质性的大小。当I2≥50%或P＜0.10，表明各研究间异质性较高，可采用随机效应模型，反之则采用固定效应模型分析[10]。若存在明显异质性，通过敏感性分析依次排除单个研究寻找差异来源，排除异质性较大的研究，再次进行Meta分析合并效应值。

通过漏斗图分析，Begg's检验(等级相关性检验)和Egger's检验(加权线性回归检验)以图形方式评估发表偏倚(P＜0.05表示存在显著发表偏倚)[13]。使用Review Manager 5.0软件和STATA version 12.0进行统计分析。

2 结果

2.1 检索结果及纳入文献的质量评价

本文根据PRISMA(Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses)声明编写了研究选择过程的详细流程图(图1)[14]。根据检索策略，共检索到相关文献3 039篇。剔除2 057篇重复文献，浏览题目和摘要后排除867篇，按纳入和排除标准全面评估，剩余30篇文献进入最终研究，其中23项研究为英文，7项为中文(表1)[1-8，15-36]。纳入的30项研究按照NOS量表的质量评价标准进行了严格的方法学质量评价，结果均为较高质量研究(评分＞5分)。

被纳入的文献均为观察性研究(病例-对照研究、队列研究)(表1)，无随机或半随机研究，其中5项为肺癌、3项为胃癌、3项为肝癌、3项为乳腺癌、8项为结直肠癌、8项为其他癌症类型(白血病、食管癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌及头颈部位肿瘤)。17项研究为亚洲人种，11项研究为欧美人种，1项为非洲人种，1项为混合人种。有25项研究使用了经典的PCRRFLP方法进行实验分析(表1)。

图1 研究流程图

表1 纳入研究的特点

2.2 Meta分析结果

纳入的30项研究显示了DNMT3B-149C＞T多态性(纯合型比较CC与TT、杂合型比较CT与TT、显性遗传型比较CC+CT与TT)与致癌风险之间的关系，共分析了癌症病例7 612名和健康对照9 679名。

2.2.1 CC与TT比较 图2显示了纯合型比较(CC与TT)的相关信息。各研究间存在异质性(Phet＜0.05，I2=70.0%)，采用随机效应模型分析，其结果显示：OR=0.96，95%CI(0.76，1.21)，P=0.73，差异无统计学意义，说明DNMT3B-149C＞T多态性纯合型对所统计癌症的整体致癌风险影响不大。采用依次逐个剔除纳入研究的方法探讨单个研究对整体结果的影响程度，敏感性分析显示：没有单个研究对合并的OR值造成显著变化；整体异质性波动不大(Phet＜0.05，I2＞66.0%)。以上分析说明Meta分析结果的稳定性较好。

按癌症类型进行亚组分析(表2)，在肺癌组[OR=1.51，95%CI(1.08，2.12)，P=0.02；I2=47.0%]有统计学意义。在胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌及其他癌症组，均无统计学意义(P＞0.05)，说明DNMT3B-149C＞T多态性纯合型对上述癌症风险影响不大。按种群进行亚组分析(表2)，未能在亚洲和高加索人群中检测到DNMT3B-149C＞T多态性纯合型与致癌风险之间存在显著关联。按研究方法进行亚组分析(表2)，表明研究方法不影响DNMT3B-149C＞T多态性纯合型对致癌风险的作用。

图2 DNMT3B-149C＞T多态性(纯合型比较CC与TT)与致癌风险相关性的森林图

2.2.2 CT与TT比较 图3显示了杂合型比较(CT与TT)的相关信息。各研究间存在异质性(Phet＜0.05，I2=67.0%)，采用随机效应模型分析，其结果显示：OR=1.05，95%CI(0.86，1.28)，P=0.65，差异无统计学意义，说明DNMT3B-149C＞T多态性杂合型对所统计癌症的整体致癌风险影响不大。采用依次逐个剔除纳入研究的方法探讨单个研究对整体结果的影响程度，敏感性分析显示：没有单个研究对合并的OR值造成显著变化；整体异质性波动不大(Phet＜0.05，I2＞62.0%)。以上分析说明Meta分析结果的稳定性较好。

按癌症类型进行亚组分析(表2)，在肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌及其他癌症组，均无统计学意义(P＞0.05)，说明DNMT3B-149C＞T多态性杂合型对上述癌症风险影响不大。按种群进行亚组分析(表2)，未能在亚洲和高加索人群中检测到DNMT3B-149C＞T多态性杂合型与致癌风险之间存在显著关联。按研究方法进行亚组分析(表2)，表明研究方法不影响DNMT3B-149C＞T多态性杂合型对致癌风险的作用。

图3 DNMT3B-149C＞T多态性(杂合型比较CT与TT)与致癌风险相关性的森林图

2.2.3 CC+CT与TT比较 图4显示了显性遗传型比较(CC+CT与TT)的相关信息。各研究间存在异质性(Phet＜0.05，I2=69.0%)，采用随机效应模型分析，其结果显示：OR=1.00，95%CI(0.82，1.22)，P=0.98，差异无统计学意义，说明DNMT3B-149C＞T多态性显性遗传型对所统计癌症的整体致癌风险影响不大。采用依次逐个剔除纳入研究的方法探讨单个研究对整体结果的影响程度，敏感性分析显示：没有单个研究对合并的OR值造成显著变化；整体异质性波动不大(Phet＜0.05，I2＞66.0%)。以上分析说明Meta分析结果的稳定性较好。

按癌症类型进行亚组分析(表2)，在肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌组及其他癌症组，差异均无统计学意义(P＞0.05)，说明DNMT3B-149C＞T多态性显性遗传型对上述癌症风险影响不大。按种群进行亚组分析(表2)，在亚洲和高加索人群中的DNMT3B-149C＞T多态性显性遗传型与致癌风险之间不存在显著关联。按研究方法进行亚组分析(表2)，表明研究方法不影响DNMT3B-149C＞T多态性显性遗传型对致癌风险的作用。

2.3 发表偏倚

DNMT3B-149C＞T多态性(纯合型比较CC与TT、杂合型比较CT与TT、显性遗传型比较CC+CT与TT)与致癌风险相关性的漏斗图见图5～6，漏斗图的视觉检查未发现实质性的不对称性，而Begg秩相关法和Egger回归法均未显示发表偏倚(表2)。

图4 DNMT3B-149C＞T多态性(显性遗传型比较CC+CT与TT)与致癌风险相关性的森林图

图5 DNMT3B-149C＞T多态性(纯合型比较CC与TT)与致癌风险相关性漏斗图

3 讨论

DNA的异常甲基化模式已在多种人类肿瘤中被揭示，肿瘤细胞中DNA甲基化异常主要表现为特定基因位点的高甲基化和基因组的整体低甲基化，这已成为肿瘤的重要表观遗传学变异特征之一。DNA甲基转移酶家族(DNMTs)在维持和催化DNA甲基化过程中起到重要的作用，哺乳动物中DNA甲基化的从头合成催化过程主要以DNMT3B为主[30]。Ho等[37]研究表明DNMT3B基因编码区甲基化增加与结直肠腺瘤的发病几率呈正相关OR=1.34；95%CI(1.01，1.79)，由于结直肠腺瘤是结直肠癌的癌前病变，这就为早期发现癌变及肿瘤治疗提供了新的方向。Lin等[38]研究表明DNMT1、DNMT3A和DNMT3B三种蛋白在肺癌组织中协同高表达，且DNMT3B高表达与抑癌基因的高甲基化明显相关(P=0.012)，提示DNMT3B在肺癌的发生中起重要作用。DNMT3B基因的高表达使患癌风险增加，其原因可能是通过调节其他基因的甲基化状态来发挥作用。

图6 DNMT3B-149C＞T多态性与致癌风险相关性漏斗图

表2 DNMT3B-149C＞T多态性与致癌风险之间相关性的亚组分析

单核苷酸多态性(SNPs)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上[16，32]。研究表明，基因启动子区的变异不仅会影响基因表达、还会影响酶的活性，从而增加致癌风险[6-7]。目前已有多篇DNMT3B基因启动子区C46359T多态性与肺癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤易感性相关的研究报道。2002年Shen等[8]研究显示在肺癌中，DNMT3B启动子区-149位SNP位点的C＞T转换使转录活性增加30%，使mRNA表达和酶活性增加，认为其增加了肺癌的易感性。李渊等[15]研究发现正常人中CT基因型发生急性白血病的危险性是TT基因型的4.669倍，提示DNMT3B-149C＞T多态性是一种可能的肿瘤预测等位基因。

本文采用Meta分析方法，综合近30年国内外公开报道的研究结果表明，DNMT3B-149C＞T多态性与所统计癌症的整体致癌风险无关，这与已有研究[9-11]报道的结果基本一致。这一结果产生的可能原因为：①癌症是一种复杂的疾病，受遗传和环境因素的双重影响，DNMT3B-149C＞T多态性可能不是癌症风险的独立诱发因素；②采取了全面检索已发表的研究文献、使用严格的纳入及排除标准、精确的数据提取与分析等一系列降低异质性的手段后，仍旧存在异质性；③不同类型癌症的发病机制不同，DNMT3B-149C＞T多态性可能只参与部分癌症的发生与发展。

按照不同癌症类型进行亚组分析时，我们发现DNMT3B-149C＞T多态性纯合型与肺癌致病风险有关，且与CC基因型相比，TT基因型增加了患肺癌的风险。本文未得到DNMT3B-149C＞T多态性与其他癌症有关联的结果，可能是不同类型的癌症具有不同的起始和进展机制，此多态性在不同的癌症类型中作用有所不同，且本文纳入的各类癌症研究文献数量有限。分别按种群和研究方法进行亚组分析，我们发现异质性来源与种群和研究方法均无关。鉴于DNMT3B可能在肿瘤发生过程中起致癌作用；且在生物学上，DNMT3B多态性可能通过增加启动子活性，来调节某些肿瘤抑制基因中CpG岛的重新甲基化[30]。研究这种多态性，可能有助于我们更好地了解肿瘤的生物学行为，预测肿瘤的遗传易感性以及选择适宜的个体疗法。

本次Meta分析也存在着一些局限性：①同种癌症相关的文献数量较少，可纳入的样本量较小，无法由小样本量的研究推及可信的整体结论，由于样本量有限和/或种族差异，无法由个别研究结果推出可靠的总体结论；②不同癌症具有不同的病理类型，如小细胞肺癌、肺鳞癌、肺腺癌等，DNMT3B-149C＞T多态性在不同病理类型发挥的作用可能有差异；③纳入的原始文献中的研究对象有关信息(如饮食习惯、环境因素等)无法提取，因此无法对混杂因素进行亚组分析；④不同纳入文献的研究者进行实验和数据处理时，所依据的操作标准会有所不同，也会造成偏倚。

综上所述，DNMT3B-149C＞T多态性可能是肺癌易感性因素；DNMT3B基因启动子区-149位TT基因型发生肺癌的危险性明显高于CC基因型。由于本次研究存在诸多的局限性，尚待更多高质量、大样本循证医学证据的出现，来进一步证实这一结论。