纳米二氧化钛对IEC-6细胞炎症因子表达及JAK 2/STAT3蛋白磷酸化的影响

刘 静，张小强，*，王 旭，苗歆雨，卢晓星

(1．东南大学公共卫生学院，江苏 南京 210009；2．东南大学环境医学工程教育部重点实验室，江苏 南京 210009)

近年来，用于食品的二氧化钛(titanium dioxide，TiO2)已被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)和欧洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)认定为是一种安全的食品添加剂[1]。然而，Kim等[2]在标注含TiO2的食品中检测出一定量的纳米二氧化钛(titanium dioxide nanoparticles，nano-TiO2)。肠道是大多数营养物质消化和吸收的场所，易与经口摄入的外来污染物相互作用。研究发现，经口暴露的nano-TiO2富集在肠道上皮细胞层[3]，诱导肠道隐窝结构改变以及紧密连接蛋白和炎症相关基因表达异常[4-5]。上述病理表现提示肠道可能作为nano-TiO2的靶器官之一，出现不良反应。迄今为止，有关nano-TiO2肠道毒性的研究相对较少。考虑到人群每日经口暴露于nano-TiO2的机会增加，关于nano-TiO2肠道毒性效应及相关机制值得深入探讨。因此，本研究选择不同浓度的nano-TiO2刺激肠道上皮细胞(intestinal epithelial cells，IEC-6)，观察 nano-TiO2对细胞活性和炎症因子表达的影响，探讨nano-TiO2是否导致IEC-6细胞炎症反应及相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要材料和试剂 大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)购于中国科学院昆明细胞库；nano-TiO2粉末，购于德国Degussa公司；DMEM高糖培养基购于美国HyClone公司；胎牛血清购于美国Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液购于美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购于美国Sigma公司；IL-1β、IL-6和TNF-α双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒购于南京森贝伽生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购于北京康为世纪生物技术有限公司；JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗体、山羊抗兔二抗IgGHRP、Western blot鲁米诺试剂均购于美国Santa Cruz公司。

1.1.2 主要仪器 Olympus IX51倒置相差显微镜购于日本Olympus公司；Esco二氧化碳培养箱购于新加坡Esco公司；JEM-2100型透射电镜购于日本JEOL公司；Zetasizer Nano-ZS90型马尔文粒径分析仪购于英国马尔文仪器有限公司；RT-6000酶标分析仪购于美国Rayto公司；5417R高速冷冻离心机购于德国Eppendorf公司；Mini-Protein 3小型垂直电泳槽购于美国Bio-Rad公司；DYCZ-40D转印电泳槽购于北京六一仪器厂；JY600C电泳仪购于北京君意东方电泳设备有限公司；Tanon 5200化学发光成像系统购于上海天能科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制备nano-TiO2染毒悬液 使用电子天平精确称量10.0 mg nano-TiO2粉末，120℃加热2 h杀菌处理，加入10 mL完全培养基配成1 mg/mL的母液，置于4℃冰箱保存待用。使用前100 Hz超声震荡30 min，根据实验需要稀释成相应浓度。

1.2.2 肠道上皮细胞的培养 将大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素与100 mg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。每隔1 d换液1次，每3～4 d传代一次。当细胞培养至对数生长期时进行实验。

1.2.3 nano-TiO2颗粒表征 取nano-TiO2悬液滴加在铜网上并烘干，在样品表面镀上具有导电性的金膜，将样品放入透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)样品仓，在加速电压200 kV下，观察nano-TiO2的粒径。取一定量的nano-TiO2染毒悬液，超声处理30 min，使用马尔文粒径分析仪检测nano-TiO2的平均水合粒径、分散系数(polydispersity，PDI)和Zeta电位。

1.2.4 MTT法测定细胞存活率 待IEC-6细胞培养至对数生长期，调整浓度为1×105个/mL，以每孔100μL接种于96孔培养板，在37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后分为调零组、对照组和nano-TiO2处理组(浓度分别为5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL)培养24 h，每组5个复孔。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10μL继续培养4 h，弃上清。每孔加150μL的DMSO，震荡5～10 min，使结晶物充分溶解。酶标仪检测吸光度D(570)值，并计算细胞存活率。

1.2.5 ELISA法检测IL-1β、IL-6和TNF-α水平 将对数生长期的IEC-6细胞调整浓度为2×105个/mL，以每孔500μL接种于24孔培养板上，待细胞贴壁后，实验分组同1.2.4，处理24 h后取细胞培养液上清3 000 r/min离心20 min，收集离心后的培养液上清。各细胞因子水平应用ELISA双抗体夹心法测定，按照ELISA试剂盒说明书进行，操作完毕后用酶标仪测定吸光度D(450)值。根据标准曲线分别确定样品中IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.2.6 Western blot法检测JAK2/STAT3蛋白表达及其磷酸化水平 将处于对数生长期的IEC-6细胞以浓度为6×105个/mL接种于直径为6 cm培养皿中，细胞贴壁后，分组同1.2.4，加入nano-TiO2。用RIPA裂解液提取蛋白，在4℃、12 000 r/min条件下，离心15 min，吸取上清，-80℃冰箱保存。用BCA蛋白定量试剂盒确定所得蛋白浓度后，在制备好的分离胶中加入样品，SDS-PAGE电泳，待溴酚蓝到达下层胶的底部停止电泳。蛋白转移至PVDF膜，将膜置于封闭液中37℃封闭2 h，加入成比例稀释的一抗，4℃孵育过夜，加入1∶5 000稀释的二抗室温孵育2 h，ECL显影，使用Image J软件扫描分析条带灰度值。

1.3 统计学方法

所有实验数据均以xˉ±s表示。应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，多组之间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。两两比较时，若方差齐则采用LSD-t检验；若不齐则选择Dunnett’s T3检验，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 nano-TiO2的表征

TEM检测结果见图1，显示分散在细胞培养基中的nano-TiO2形态不规则，颗粒团聚。粒径仪检测到颗粒的平均水合粒径为(64.59±2.05)nm，PDI为(0.23±0.01)，Zeta电位为(-5.27±0.21)mV，上述结果提示nano-TiO2的混合分散体系较为稳定。

图1 nano-TiO2表征

2.2 nano-TiO2对IEC-6细胞存活率的影响

MTT法测定细胞存活率结果见图2，与对照组相比，各个nano-TiO2处理组(5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL)IEC-6细胞活性差异无统计学意义(P＞0.05)，说明本试验浓度的nano-TiO2对IEC-6细胞活性未产生明显影响。

图2 nano-TiO2对IEC-6细胞存活率的影响

2.3 nano-TiO2诱导IEC-6细胞释放IL-1β、IL-6、TNF-α因子

ELISA法测定IEC-6细胞分泌炎症因子结果见图3，IEC-6 细胞给予 10.0、15.0、20.0 μg/mL nano-TiO2染毒处理后，与对照组相比，细胞IL-1β分泌增加(P＜0.05)；与对照组相比，nano-TiO2各个浓度(5.0、10.0、15.0、20.0 μg/mL)作用组中IEC-6细胞IL-6和TNF-α水平均明显升高(P＜0.05)，且nano-TiO2染毒剂量与上述促炎性因子分泌水平呈剂量依赖性增加(rIL-1β=0.870， P＜0.01； rIL-6=0.938， P＜0.01； rTNF-α=0.982，P＜0.01)。

2.4 nano-TiO2引起IEC-6细胞JAK2/STAT3蛋白磷酸化

图3 nano-TiO2对IEC-6细胞IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影响

Western blot实验的结果见图4，与对照组相比，在浓度为15.0和20.0μg/mL nano-TiO2作用下p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平明显增加(图4A)，且p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平与炎症因子分泌水平呈正相关关系(rJAK2，IL-1β=0.561，P＜0.05；rJAK2，IL-6=0.711，P＜0.01；rJAK2，TNF-α=0.675，P＜0.01；rSTAT3，IL-1β=0.782，P＜0.01；rSTAT3，IL-6=0.532，P＜0.05；rSTAT3，TNF-α=0.668，P＜0.01)。灰度值分析结果(图4B和图4C)显示，IEC-6细胞在15.0和20.0μg/mL nano-TiO2作用下，JAK2和STAT3蛋白磷酸化水平明显增加，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图4 nano-TiO2对IEC-6细胞JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平的影响

3 讨论

纳米颗粒作为一种新兴材料，因其具有特殊的物理化学特性被使用于工业、生物医药[6]和食品行业[7]。随着应用途径多样化，纳米颗粒可随食品经口分布于机体肠道。肠道中的肠道屏障主要由肠道上皮细胞和细胞间的紧密连接构成，能有效隔离外源性有害物质到达机体内部。当肠道屏障遭到破坏，可能诱导肠道炎性疾病发生，进而导致结直肠癌[8]。因此，评价nano-TiO2对肠道上皮细胞的毒性效应对nano-TiO2的安全性评估具有重要意义。

本实验结果表明，nano-TiO2对体外培养的IEC-6细胞存活率无显著影响，这与YE等[9]的研究一致。一般来说，nano-TiO2的毒性具有时间和剂量依赖性[10-11]。而本研究的IEC-6细胞仅单次暴露于较低浓度的nano-TiO2且接触时间较短(24 h)，可能尚未表现出nano-TiO2的细胞毒性。考虑到各年龄段人群每日经口摄入nano-TiO2的频率和用量的差异性[12]，未来可能需要进行高剂量和长期染毒实验进一步确证重复暴露nano-TiO2对人体肠道的影响。

一项有关金属纳米毒性对比的研究发现，不同的金属纳米颗粒对细胞活性的影响差异较大，但是却都能引起细胞相关炎性因子分泌[13]。所以，本研究在发现nano-TiO2不影响IEC-6细胞活性后，我们对nano-TiO2能否引起肠道细胞炎症反应进行评估。本实验结果表明，较低浓度的nano-TiO2(5和10μg/mL)就能刺激细胞显著分泌炎性相关因子。这可能是因为细胞将纳米颗粒识别为外源性物质，极低浓度的nano-TiO2(1×10-3μg/mL)也可能引起细胞一系列炎性反应[14]。然而，Tada-oikawa等[15]发现高于25 μg/mL nano-TiO2浓度作用下，肠道细胞才开始分泌较高水平的IL-1β。出现相悖结果的原因可能是不同细胞种属对nano-TiO2敏感性不一[16]，导致反应浓度出现差异。另外，根据晶型分类，常见的nano-TiO2主要来源有3种：锐钛矿、金红石和板钛矿。本实验采用的是与食品添加剂成分相似的锐钛矿与金红石混合物[17]，而Tada-oikawa等[15]的研究选用100%纯度的锐钛矿染毒。nano-TiO2成分差异可能是导致不同结果的原因之一。

JAK2/STAT3通路是参与调节炎症反应的重要通路之一。有研究分析发现，IL-6的表达与STAT3磷酸化水平呈正相关关系[18]。本实验在nano-TiO2刺激下，IEC-6细胞中JAK2蛋白和STAT3蛋白磷酸化水平增加，说明JAK2/STAT3信号通路可能被激活。随着nano-TiO2剂量增加，JAK2/STAT3两种蛋白磷酸活化水平与3种炎症相关因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的分泌水平变化趋势一致。因此，我们推断nano-TiO2引起肠上皮细胞炎症因子的表达可能与JAK2/STAT3蛋白磷酸活化相关。研究发现，JAK2通路抑制剂(AG490)能大幅度缓解JAK2/STAT3蛋白的激活和相关炎症因子的产生[19]，这提示JAK2/STAT3信号通路参与炎症的发生发展。今后，我们将利用JAK2/STAT3通路的抑制剂探索nano-TiO2是否通过JAK2/STAT3信号通路诱导IEC-6细胞分泌炎症因子。Fukatsu等[20]的研究发现，nano-TiO2的炎症反应在核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)抑制剂作用下逐渐减轻，表明NF-κB通路同样参与纳米引起的炎症反应。除此之外，nano-TiO2暴露伴有炎症产生的同时还引起小鼠中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族的p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)表达上调[21]以及细胞中蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38 MAPK等蛋白磷酸化水平增加[22-23]。由此，我们推断nano-TiO2致生物体产生炎性反应可能与多条信号通路有关，涉及JAK2/STAT3、MAPK家族和PKB等传导途径。