游泳训练通过激活Nrf2/ARE/Glo-1通路改善糖尿病大鼠认知功能障碍

申梦丽 仇欣然 马中轩 郝梦 刘耀武 鲁茜

(徐州医科大学江苏省新药研究与临床药学重点实验室，江苏 徐州 221004)

糖尿病脑病主要临床表现为认知功能减退〔1〕。氧化应激是糖尿病脑病的重要发病机制。氧化应激的作用过程与非酶性蛋白糖基化紧密相关，两者相互协同共同导致了糖尿病认知功能障碍的发生和恶化。乙二醛酶(Glo)-1是体内α-羰基醛的主要解毒酶，可及时清除丙酮醛(MG)等α-羰基醛，抑制晚期糖基化终末产物(AGEs)的生成，使机体免受糖化作用毒性，在糖尿病并发症的预防和治疗中发挥重要作用〔2〕。核转录因子(NF)-E2相关因子(Nrf)2是调节细胞抗氧化应激的重要转录因子，NF-E2通过抗氧化反应元件(ARE)相互作用调节编码抗氧化蛋白，激活Nrf2信号通路对糖尿病并发症有预防作用〔3〕。Xue等〔4〕报道，Nrf2/ARE通路可以编码Glo-1基因。在高糖培养的大鼠原代海马和皮质神经元中，激活Nrf2/ARE信号通路可上调Glo-1表达，从而发挥抗氧化应激和减少AGEs累积作用〔5〕。运动治疗能够降低血糖、改善胰岛素抵抗、预防和治疗并发症，是治疗糖尿病的重要措施〔6〕。在动物模型中，规律运动能够通过激活Nrf2对骨骼肌、心肌、肾脏、肝脏等组织器官发挥保护作用〔7〕。此外，Aguiar等〔8〕研究发现，在帕金森模型小鼠中，6 w的跑步机训练能激活大脑黑质纹状体中的Nrf2/ARE信号通路，发挥神经保护作用。然而，游泳训练对糖尿病脑病是否具有神经保护作用，目前尚未见报道。本研究观察了游泳训练对糖尿病大鼠认知功能的影响，并从Nrf2/ARE/Glo-1途径研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 Ⅰ型胶原蛋白酶、链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，核浆蛋白分离试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)试剂盒购自南京建成生物工程研究所，抗体Glo-1、Nrf2、Lamin B1均购自英国Abcam公司，抗体β-actin购自美国Bioworld公司。Morris水迷宫系统购自美国Coulbourn instruments公司，单管型多功能检测仪购自美国Promega Biosystems公司，双色红外激光成像系统购自美国LI-COR公司。

1.2实验动物 6周龄无特异病原体(SPF)级健康雄性SD大鼠56只，体重160～210 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证编号：SCXK(沪)2013-0016。实验动物在徐州医科大学实验动物中心屏障系统分笼饲养，自由进食饮水。

1.3分组及训练模型制备 随机取6只大鼠为正常组，其余采用高糖高脂饲料喂养，8 w后给予低剂量STZ 30 mg/kg腹腔注射。STZ注射72 h后眼眶采血，测定空腹血糖≥13.9 mmol/L为糖尿病大鼠模型制备成功。将造模成功的糖尿病大鼠随机分为糖尿病模型组(DM，n=12)和游泳训练组(n=38)。所有游泳训练组大鼠需进行1 w适应性游泳训练，并逐天增加其训练时间(分别为10、20、30、40、50、60、70 min/d)。随后随机分为低强度游泳(LM)组(n=13)，中强度游泳(MM)组(n=12)、高强度游泳(HM)组(n=13)，3组每周进行5次无负重游泳训练，训练时间分别为30 min/次、60 min/次、120 min/次，共8 w。游泳水温为25.5℃±0.5℃，水池直径150 cm，水深35 cm。

1.4学习记忆能力测试 在游泳训练8 w后，对各组大鼠采用Morris水迷宫检测大鼠的空间学习记忆能力〔9〕。定位航行试验：先进行连续4 d的获得性训练，将大鼠分别从4个象限放入水中，并且头朝池壁入水。记录大鼠寻找到隐藏在水面下平台所需要的时间(称潜伏期)。设定最长游动时间为90 s。90 s未找到平台者，将其引导至平台，放置20 s，引导其学习与记忆。分析潜伏期，考察学习能力。空间探索试验：第5天进行空间探索实验，测试记忆能力。撤掉隐藏平台，从之前平台的对侧象限将大鼠放入水中。在90 s内记录大鼠穿过平台位置的次数及目标象限所占时间百分比。

1.5氧化应激指标测定 在水迷宫实验完成后即刻断头处死大鼠，取大鼠脑海马组织，以磷酸盐缓冲液(PBS)制成10%匀浆液，3 500 r/min、4℃离心15 min，取上清液，按试剂盒说明书检测T-SOD酶活力及GSH含量。

1.6AGEs含量测定 将海马组织沉淀物用双蒸水洗涤3次，然后加入氯仿/甲醇混合液(1∶1)1 ml，37℃恒温震荡过夜。离心去上清，沉淀中加入0.5 ml甲醇/水混合液(4∶1)，6 000 r/min、4℃离心5 min。将沉淀分别用甲醇洗涤2次，用双蒸水洗涤1次。然后将沉淀物用0.02 mol/L Hepes缓冲液(含0.1 mol/L氯化钙)洗涤2次，后加入1 ml 0.02 mol/L Hepes缓冲液4℃过夜。离心去上清，沉淀物中加入1 ml Hepes缓冲液(含290 U I型胶原酶、2 μl甲苯、2 μl氯仿)，37℃恒温震荡24 h。离心取上清，用荧光分光光度法测定AGEs含量，激发光波长和吸收光波长分别为370 nm、440 nm。以只含Ⅰ型胶原酶的Hepes缓冲液为空白管，结果以荧光单位AUF/mg蛋白表示，所用仪器为单管型多功能检测仪。

1.7海马组织Nrf2、Glo-1表达检测 取大鼠脑海马组织，放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解液：蛋白酶抑制剂(PMSF)=100∶1配置匀浆液，配好的匀浆液(ml)：组织重量(g)=5∶1，冰浴中匀浆，并在冰上裂解30 min，匀浆液于10 700 r/min，4℃离心15 min后取上清；严格按照核浆分离试剂盒说明书进行海马组织核浆分离。采用二喹林甲酸(BCA)法进行蛋白浓度测定。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，半干转至硝酸纤维素(NC)膜上，3%脱脂奶粉封闭1 h。再分别与兔抗Nrf2多克隆抗体(1∶750)、兔抗Lamin B1单克隆抗体(1∶1 000)、兔抗Glo-1单克隆抗体(1∶1 000)、β-actin抗体(1∶1 000) 4℃反应过夜。洗膜，加入二抗(1∶1 000)，室温避光孵1 h。将条带用双色红外激光成像系统扫描，保存所得图像，用Image J软件进行光密度分析，以Glo-1，Nrf2与内参光密度的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.8统计学方法 采用SPSS16.0软件进重复测量方差分析、单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1游泳训练对糖尿病大鼠学习记忆能力的影响 在定位航行试验中，DM组逃避潜伏期明显高于正常组(P<0.01)。与DM组相比，LM组逃避潜伏期在第2～4天明显降低(P<0.01)；MM组逃避潜伏期在第1～3天明显降低(P<0.05或P<0.01)；HM组逃避潜伏期在第1～4天内均明显降低(P<0.05或P<0.01)。在空间探索实验中，DM组穿过平台位置的次数和目标象限时间百分比明显低于正常组(P<0.05或P<0.01)。与DM组相比，MM组和HM组穿过平台位置次数和目标象限时间百分比明显增高(P<0.05)。见表1。

表1 Morris水迷宫实验结果

与正常组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与DM组比较：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同；5)Morris水迷宫实验后存活大鼠只数

2.2游泳训练对糖尿病大鼠海马组织抗氧化作用的影响 与正常组相比，DM组大鼠海马中T-SOD酶活力和GSH水平显著性降低(P<0.01)。与DM组相比，LM、MM、HM组的T-SOD酶活力显著性升高(P<0.05或P<0.01)，LM、MM组的GSH水平则显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 游泳训练对糖尿病大鼠海马组织抗氧化酶活力的影响

2.3游泳训练对糖尿病大鼠海马中AGEs水平的影响 与正常组相比，DM组大鼠海马组织中AGEs相对含量明显升高(P<0.01)。与DM组相比，MM、HM组大鼠海马组织中AGEs均显著降低(P<0.05或P<0.01)。见表3。

2.4游泳训练对糖尿病大鼠海马组织胞核和胞质中Nrf2表达的影响 与正常组相比，DM组大鼠胞质胞核Nrf2表达减少(P<0.05)。与DM组相比，MM、HM组大鼠海马组织中胞质Nrf2表达减少(P<0.05)，胞核Nrf2表达量明显高于DM组(P<0.05或P<0.01)。见表3、图1。

2.5游泳训练对糖尿病大鼠海马组织中Glo-1表达的影响 与正常组(0.91±0.17)相比，DM组大鼠海马组织中Glo-1表达(0.57±0.15)显著减少(P<0.01)。与DM组相比，MM、HM组大鼠海马中胞质Glo-1表达(0.88±0.25、0.80±0.24)显著增加(P<0.01或P<0.05)。LM组(0.77±0.12)与DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

表3 游泳训练对糖尿病大鼠海马组织中AGEs及Nrf2蛋白水平的影响

图1 游泳训练对糖尿病大鼠海马组织胞质和胞核中Nrf2蛋白表达的影响(n=6)

图2 游泳训练对糖尿病大鼠海马组织中Glo-1蛋白表达的影响(n=6)

3 讨 论

运动疗法在2型糖尿病患者的血糖控制、体重减轻和并发症预防等方面扮演着重要角色〔9〕。Reisi等〔10，11〕的研究发现12 w的跑台运动可以预防和改善糖尿病大鼠认知功能减退，其潜在机制尚不清楚。本实验表明中高强度游泳训练能够发挥脑神经保护作用，明显改善了糖尿病大鼠学习记忆能力。

研究发现，糖尿病患者处于长期高血糖和氧化应激状态，产生大量的MG，并累积生成AGEs〔12〕。MG和AGEs具有很强的糖化活性，可修饰蛋白质引起细胞毒性和组织损伤，进而使细胞、组织形态与功能发生改变，在糖尿病并发症的发生发展中起着关键作用〔2〕。Glo-1是体内α-羰基醛代谢系统的限速酶，与Glo-2和辅因子还原型GSH组成乙二醛酶系统〔12〕。该系统在GSH的参与下，将高糖化活性的α-羰基醛催化生成相应的无糖化活性的α-羟基酸，是体内α-羟基醛的主要解毒系统〔2〕。Brouwers等〔13〕研究发现，在糖尿病大鼠中，过表达Glo-1能够降低高糖诱导的AGEs和氧化应激水平。Glo-1在抑制AGEs形成中起关键作用，是防治糖尿病并发症的靶点〔2〕。本实验提示游泳训练可以通过增强Glo-1表达、减少MG的蓄积、抑制AGEs的生成，延缓糖尿病脑病病情进展。

Nrf2通过与ARE相互作用调节编码抗氧化蛋白，是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路，激活Nrf2/ARE信号通路后能够调节下游多种保护基因的表达〔14〕。研究表明〔4〕，Glo-1是Nrf2/ARE信号通路的下游靶基因。在高糖条件下培养的海马和皮质神经元中，Nrf2诱导剂可以通过激活Nrf2/ARE信号通路增强Glo-1功能。本实验结果显示游泳训练很可能是通过激活Nrf2/ARE信号通路，进而增强下游Glo-1蛋白表达，减少AGEs蓄积，对抗氧化应激，发挥保护防御作用。

综上，中高强度游泳训练能够明显提高糖尿病模型大鼠的学习记忆能力，并且这种改善作用可能是通过激活Nrf2/ARE通路，增强通路下游Glo-1蛋白表达，抑制氧化应激和非酶糖基化实现的。