微小RNA-29a在肺动脉高压模型大鼠肺动脉血管壁组织中的表达及对肺动脉高压大鼠的影响

高继勇 李福海

(山东大学 1临床医学院，山东 济南 250012；2齐鲁医院)

肺动脉高压目前尚无特效疗法，经手术治疗后患者的预后往往不理想，而药物治疗包括前列腺素等，均能对内皮细胞的舒缩进行调节，能够一定程度改善肺动脉高压持续升高，但远期患者的存活率相对较低〔1,2〕。微小RNA(miRNA)由约23个核苷酸单链RNA分子组成，其主要作用为参与体内基因的调控，对于细胞有调节作用。miRNA表现形式并不统一，可以使多个miRNA对相同基因产生调节作用，也可以由单一的miRNA参与数个靶基因，因此在生物学中可以由miRNA对基因组进行不同的调节表达。研究证实〔3〕，miRNA在人体中参与了三分之一的基因调节，是人体内重要的调节机制。miRNA-29a是miRNA-29家族中的重要组成，有学者在大鼠实验中发现miRNA-29的表达直接影响了机体脏器功能的正常作用机制，可引起心血管疾病，是导致动脉粥样硬化的独立危险因素〔4〕。

1 材料与方法

1.1动物和材料 选取36只雄性Wistar大鼠，重量200～250 g，平均(234.1±11.8)g，清洁级，由实验动物中心提供，在恒温、恒湿环境中饲养。野百合碱由成都德锐可生物科技有限公司提供，将野百合碱与1 mol/L稀盐酸融合配比，制成浓度为1%的混合溶液，用氢氧化钾调节溶液pH7.2，之后与生理盐水进行配置备用。miRNA-29a-NC和miRNA-29a-mimic均由上海锐赛生物有限公司提供。

1.2方法

1.2.1大鼠模型建立 将36只大鼠随机分为对照组(正常大鼠)、第一组(野百合碱诱导)、第二组(miRNA-29a-NC尾注)和第三组(miRNA-29a-mimic尾注)，每组8只。第一、二、三组大鼠均给予皮下注射野百合碱预制溶液50 mg/kg，注射后保持之前的饲养环境，正常饮水，待注射1个月后对第二、三组分别使用胰岛素注射器进行尾静脉注射miRNA-29a-NC和miRNA-29a-mimic。

1.2.2检测方法

1.2.2.1miRNA-29a表达测定 从试剂盒中提取总RNA，根据说明书操作。miRNA-29a上游引物5′CGCATCCAGACCAACAACAACC-3′;下游引物5′AGAGCCGCACAGCATTCAGG-3′；内参照U6：上游引物5′CATGCCATTGAGAAAGCCTTCC-3′，下游引物5′AGAGTTGTCCCGATGATCTCC-3′；PCR反应体积25 μl，反应条件：预变性95℃、30 s；循环条件：95℃、10 s，60℃、30 s，40个循环。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统扫描。

1.2.2.2血流动力学检测 四组大鼠按照体重每100 g腹腔注射50 U肝素〔5,6〕，注射完成5 min后应用10%氨基甲酸乙酯进行腹腔麻醉，通过右颈静脉施行右心室插管操作，选取20号套管针从右心室穿刺直达肺动脉主干，详细记录每组大鼠的肺动脉压，之后将导管退出，于大鼠近心端进行结扎，再由右颈总动脉处进行导管置入，记录体循环动脉压。

1.2.2.3形态分析 完成以上检测后将大鼠处死，完整解剖分离大鼠左肺，并进行切片、染色处理，在光学显微镜下观察大鼠肺动脉组织的形态特征，利用计算机图像分析中膜厚度与血管直径的百分比(WT%)及中膜面积与血管壁面积的百分比(WA%)。

1.3统计学方法 应用SPSS18.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1miRNA-29a表达对比 四组miRNA-29a表达差异较大，第一、二组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；且转染miRNA-29a-mimic后1个月，第三组miRNA-29a表达明显升高，与第一、二组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2血流动力学对比 除对照组外，其余三组肺动脉压明显升高，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；且第三组肺动脉压明显低于第二组(P<0.05)。四组体循环动脉压差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

与对照组比较：1)P<0.05；与第一、二组比较：2)P<0.05图1 各组miRNA-29a表达

组别肺动脉压体循环动脉压对照组20.83±1.7685.26±5.31第一组37.91±2.081)84.78±5.16第二组36.54±1.991)84.35±4.97第三组29.32±2.841)2)86.23±5.28

与对照组比较：1)P<0.05；与第一、二组比较：2)P<0.05；下表同

2.3肺动脉形态结构 第一、二、三组肺动脉中膜均有增厚情况，可见到明显的血管重构，与对照组比较，WT%与WA%差异均有统计学意义(P<0.05)，第三组与第一、二组比较，转染miRNA-29a-mimic大鼠的中膜增厚程度较低，WT%与WA%差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 四组WT%与WA%对比

3 讨 论

调查发现〔7〕，在动植物及病毒中都存在着miRNA分子，已有两万多个miRNA分子被记录，miRNA普遍以拷贝或者基因簇的形式结合在基因组中。miRNA在基因中多处于高度保守位置，并且序列中表现出同源性，高度保守的位置与miRNA的生物作用有直接的联系，故miRNA能够准确反映靶基因的进化机制及功能。miRNA最先在线虫中被发现，通过未知的蛋白抑制方式达到了抑制蛋白质合成的目的，应用miRNA对一组关键基因进行调控，对线虫的正常发育起到了有效的控制作用〔8〕。高度保守的RNA分子通过与非编码区结合，从而实现抑制翻译作用，加速了靶基因的降解作用〔9〕。

金强等〔10〕将24只大鼠平均分成四组，应用野百合碱对大鼠肺动脉高压进行诱导，并通过腺病毒诱导型一氧化氮合成酶(eNOS)介导基因转移，达到对大鼠肺组织表达调控的作用，结果显示明显减少了白细胞介素(IL)-6的水平；腺病毒eNOS介导基因转移能够促进肺血管扩张，同时对炎症因子的活性抑制作用明显，以此达到肺动脉高压大鼠肺部血管结构重建的作用，同时有效调控大鼠的肺动脉压力。野百合碱是一种豆科类植物，归属于野百合，临床中多用于肺动脉高压的动物模型诱导〔11〕。本研究结果发现，当机体出现miRNA-29a低表达时能够导致肺动脉病变及血压升高，转染miRNA-29a-mimic后能够调控肺动脉压，改善了肺血管组织的重构，推测miRNA-29a的表达水平能够影响机体的肺组织状况，转染miRNA-29a-mimic后改善效果明显，表明miRNA-29a在野百合碱诱导肺动脉高压大鼠模型肺组织血管壁中能够阻滞肺组织细胞的凋亡，恢复重建血管结构，降低肺动脉压水平。郑常龙等〔12〕用野百合碱诱导大鼠肺动脉高压，观察到转化生长因子(TGF)-β1/Smad2信号通路也参与了肺动脉高压形成的过程，同时野百合碱注射后模型大鼠的体重明显低于正常大鼠体重(P<0.05)；野百合碱诱导大鼠肺动脉高压主要通过对信号通路的干预，达到影响大鼠肺动脉血管壁的目的。常成等〔13〕认为野百合碱诱导大鼠肺动脉高压形成主要通过激活Jagged2/Notch3信号分子。肺动脉高压形成受到多种因素的影响，遗传、基因变异、心血管病等都会导致肺动脉高压发生，掌握信号通路表达的作用能够为临床治疗打开研究的新领域，改善患者的预后。

综上所述，miRNA-29a表达水平对于肺动脉压有直接影响，高表达miRNA-29a能够改善肺动脉血管壁厚度，同时降低肺动脉压水平。这一研究结果可在临床研究中进行深入讨论，充分掌握miRNA-29a表达的作用机制，为肺动脉高压的治疗提供参考依据。