养肝解郁颗粒治疗非酒精性脂肪性肝病肝纤维化的药效学

冷炎 杨明 欧喜燕 成光宇 蒋惠军 陈星宇

(长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤〔1〕，已成为发达国家、中国沿海地区慢性肝病的主要原因。且发病率随年龄增长而升高〔2〕。养肝解郁颗粒为丹栀逍遥散化裁而来，作为院内制剂已经应用于治疗各种慢性肝炎伴有抑郁状态患者，取得了很好的保肝降酶疗效，且临床中发现该制剂对NAFLD肝纤维化的血脂、肝功及肝纤维化程度均具有一定改善作用，本研究主要观察养肝解郁颗粒治疗NAFLD肝纤维化的疗效。

1 材料与方法

1.1实验动物及试剂 SD大鼠120只，雄性，220～250 g，KM小鼠60只，雄性，18～22 g(辽宁长生生物技术有限公司)。药品与试剂：养肝解郁颗粒(长春中医药大学附属医院制剂中心)；多烯磷脂酰胆碱胶囊(赛诺菲制药有限公司)；中/长链脂肪乳注射液(广州百特侨光医疗用品有限公司)；四氯化碳(CCl4，北京化工厂)；注射用盐酸四环素(北京赛弗制药股份有限公司)；胆固醇(TC，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；氨基甲酸乙酯(国药集团化学试剂有限公司)；甲醛溶液(沈阳力诚试剂厂)；总TC测试试剂盒(COD-PAP法)，三酰甘油(TG)测试试剂盒(GPO-PAP法)，中生北控生物科技股份有限公司产品；羟脯氨酸(HYP)、基质金属蛋白酶(MMP)-9、透明质酸(HA)、 Ⅲ型前胶原蛋白(PⅢP)、层黏蛋白(LN)酶联免疫测试试剂盒，为美国R&D公司产品。实验仪器：紫外/可见分光光度计(美国Perkin Elmer公司)；Heraeus台式离心机Stratos(德国贺利氏公司)；电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1NAFLD肝纤维化模型建立 大鼠高脂高糖结合CCl4复合因素法：足量18%蔗糖溶液自由饮用，同时给予脂肪乳灌胃(10 ml/kg)，并于其背部皮下注射40%的CCl4花生油溶剂(0.1 ml/100 g)，3次/w。每周称重2次，调整给药剂量。大鼠高脂结合氧四环素复合因素法：给予复合高脂饲料饮食〔77%基础饲料基础上，加入3% TC、10%猪油和10%蛋黄粉。投食量：25 g/(鼠·d)〕，并按10 mg/100 g剂量给予氧四环素腹腔注射，每5 d给药1次。小鼠高脂结合CCl4复合因素法：给予复合高脂饲料饮食，并于第2周末开始腹腔注射5%的CCl4花生油溶剂(0.01 ml/g)，3次/w。各组均持续造模8 w。

1.2.2实验分组及给药方法 动物适应环境7 d后按体重随机分组为对照组、模型组、阳性(多烯磷脂酰胆碱胶囊)组、高、中、低剂量组。各组于建模后当日起每天灌胃给药1次，阳性组给予多烯磷脂酰胆碱胶囊〔0.25 g/(kg·d)〕，高、中、低剂量组分别给予养肝解郁颗粒〔1.728、0.864、0.432 g/(kg·d)〕，对照组及模型组给予等剂量蒸馏水，连续8 w，每周称重2次，以调整给药剂量。于8 w末，动物禁食不禁水12 h，于末次给药60 min后以20%乌来糖溶液麻醉后，腹主动脉取血，4℃，3 000 r/min，10 min，取血清保存备用。

1.2.3检测指标

1.2.3.1血清学指标检测 依照试剂盒方法检测大鼠血清中TC、TG含量；HYP、MMP-9含量；小鼠血清中HA、PⅢP、LN含量。

1.2.3.2肝病理组织学检查 甲醛固定，HE染色，光镜观察。病变评价参考卫生部《保健食品检测与评价技术规范2003版》中关于对化学性肝损伤有辅助保护作用检验方法。观察肝细胞变性(脂肪变性、水样变性、胞质凝聚、气球样变)、肝细胞坏死和炎症改变等。肝脏病变得分=肝细胞变性得分(气球样变得分+脂肪变性得分+胞质凝聚得分+水样变性得分)×1+ 肝细胞炎症改变得分×1 + 肝细胞坏死得分×2。

1.3统计学方法 应用SPSS17.0软件进行方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组血脂水平比较 与对照组比较，模型组TC、TG含量均显著升高(P<0.01,P<0.001)。阳性组及高剂量组TC、TG含量与模型组比较均明显下降(P<0.01，P<0.05)。中剂量组TC含量与模型组比较明显下降(P<0.05)，中剂量组TG含量、低剂量组TG、TC含量与模型组比较有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2各血清HYP、MMP-9含量比较 与对照组比较，模型组HYP、MMP-9含量显著升高(P<0.05,P<0.001)。阳性组及高剂量组与模型组比较HYP、MMP-9含量均明显下降(P<0.01,P<0.001,P<0.05)；中、低剂量组与模型组比较均有下降趋势，但只有中剂量组HYP含量及高脂高糖结合CCL4复合因素法MMP-9含量、低剂量组高脂高糖结合CCL4复合因素法HYP含量差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。见表1。

2.3各组血清HA、PⅢP、LN含量比较(高脂结合CCl4复合因素法) 对照组、阳性组、高、中剂量组血清HA、PⅢP、LN含量与模型组比较均明显下降(P<0.05,P<0.01,P<0.001)，低剂量组动物血清中HA、PⅢP、LN含量与模型组比较有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4各组病理形态评分比较 对照组、阳性组及高、中剂量组病理形态评分与模型组比较均明显下降(P<0.05，P<0.01)。低剂量组动物病理形态评分与模型组比较有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各组血脂、血清HYP、MMP-9含量比较

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001；下表同

表2 各组血清HA、PⅢP、LN含量(高脂结合CCl4复合因素法)及肝脏病理评分比较

3 讨 论

养肝解郁颗粒是丹栀逍遥散加减而来，具有保肝降酶、缓解肝纤维化的作用。张宁等〔3〕运用代谢组学方法探讨逍遥散对大鼠肝纤维化保护作用的机理，发现逍遥散具有改善肝功能、调节脂肪酸代谢、促进氨基酸生成等多方面作用，可能是其治疗肝纤维化的作用机制。白芍总苷具有抗急性肝损伤、NAFLD、慢性肝纤维化等多种保肝作用〔4～6〕。丹皮酚能够缓解肝纤维化过程，其作用机制可能与降低氧化应激水平有关〔7〕。茯苓皮水提取物对CCl4诱导的大鼠肝纤维化具有良好的改善作用，其机制可能与抑制机体脂质过氧化有关〔8〕。栀子苷能够通过显著抑制肝组织中转化生长因子(TGF)-β1和α-平滑肌肌动蛋白(SMA)的蛋白表达，改善肝纤维化〔9〕。

本实验结果提示养肝解郁颗粒具有降低血脂的作用；能够显著缓解肝纤维化，模型大鼠、小鼠病理形态可见模型组肝细胞发生气球样变性为主，肝细胞胞质疏松，肝细胞明显的坏死和汇管区炎细胞浸润，应用养肝解郁颗粒干预后，肝细胞气球样变的程度减轻，肝细胞以疏松变性为主，少见肝细胞坏死，少见炎细胞浸润，有效减轻肝损伤程度。

本实验部分结果无显著性差异，可能因本实验总体治疗时间较短所致，其中HYP、HA差异性较为显著，考虑该指标反应肝纤维化早期改变较为敏感。综上，养肝解郁颗粒具有明确的保肝降酶作用，可在一定程度上缓解肝纤维化程度。