ASE-CAD结合柱后补偿液相色谱法测定浙贝母中贝母素甲和贝母素乙

1.广西中医药大学，广西 南宁 530000；2.广西-东盟食品药品安全检验检测中心，广西 南宁 530000

浙贝母为百合科植物浙贝母FritillariathunbergiiMiq．的干燥鳞茎，具有清热化痰止咳，解毒散结消痈的作用[1]。其有效成分主要为生物碱，其中又以贝母素甲和贝母素乙为主[2]。文献显示其含量测定主要是采用含有毒性大的三氯甲烷溶液提取，然后采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定[1-3]，此类方法较成熟但前处理普遍耗时较长。前处理使用的ASE是一种在高温高压条件下萃取样品中有机组分的新方法，其通过维持体系内的高压状态使得溶剂在高温条件下不汽化，具有自动化，提取效率高等特点。电雾式检测器(Charged Aerosol Detector，CAD)是在2004年才推出的一种较为新型的通用型检测器，其响应值不依赖于被测物质的光学性质和离子化效率能检测非挥发或很多半挥发性的物质。研究表明，与ELSD比较，CAD 具有更高的检测灵敏度[4-5]和更加均匀一致的响应因子[6]，在中药或天然药物中的皂苷或胆酸等缺少紫外发色团的成分分析中应用较多[7-8]。柱后补偿(反梯度)即在色谱柱后进入检测器前加入另一分析溶剂，通过增加有机相比例，可以提高雾化效率，增加响应值，降低检出限，提高检测效果[9]。本研究采用快速溶剂萃取法提取浙贝母中贝母素甲和贝母素乙，并结合HPLC-CAD法进行分离测定。在实验中采用梯度洗脱与柱后补偿进行分析，进一步提高了贝母素甲和贝母素乙响应因子的一致性。本方法不仅操作简便、准确度高，而且ASE法提取时间仅为常规方法的1/8，能满足浙贝母中贝母素甲和贝母素乙的快速测定。

1 仪器与材料

1.1 仪器 XA205DU电子分析天平、ASE350快速溶剂萃取仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)、Ultimate3000双三元高速液相色谱仪(含CAD检测器，美国赛默飞世尔科技有限公司)。

1.2 材料 对照品贝母素甲(批号：110750-201311，含量按97.3%计)、贝母素乙(批号：110751-201611,含量按96.4%计)均购自中国生物制品检定研究院；实验用药品均购自当地药房(浙贝母产地浙江，批号：1510111、150827、150618；产地江西，批号151102)；水为纯化水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称定贝母素甲对照品，加甲醇制成每1 mL含贝母素甲1.4710 mg；精密称定贝母素乙对照品，加甲醇制成每1 mL含贝母素乙1.4225 mg，作为对照品贮备液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品粉末(过四号筛)约1 g，精密称定，与适量硅藻土混合均匀填充于10 mL萃取池，按快速溶剂萃取仪优化的条件进行提取，萃取溶剂为75%乙醇、萃取温度80 ℃、静态萃取时间3 min、循环萃取2次、冲洗体积60%、吹扫时间100 s，萃取结束后，将萃取液置蒸发皿中蒸至近干，残渣加甲醇使溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2 ASE萃取条件的优化 利用单因素依次考察了萃取温度(80 ℃、90 ℃、100 ℃)，静态萃取时间(3、5、10 min)、循环次数(1次、2次、3次)。结果如图2所示，结果表明结果不同的温度和不同的萃取时间下贝母素甲和贝母素乙的总量没有明显差异；循环次数升到2次以后，总量即没有明显增加。最终确定最佳提取工艺组合为提取温度80 ℃，提取时间3 min，提取次数2次，冲洗体积60 %，吹扫时间100 s。

2.3 色谱条件 色谱柱：ACE Excel C18-AR(2.1×50 mm，1.7 μm)；分析泵(右泵)流动相：乙腈-0.1%氨水，梯度洗脱：0 ～1 min，40%～40%乙腈，1～5 min，40%～60%乙腈，平衡时间为4 min；柱温：40 ℃；流速0.3 mL/min；电喷雾检测器(CAD)检测，CAD雾化器温度为45 ℃；进样量5 μL。补偿泵(左泵)流动相：乙腈-水，启用Chromeleon 7工作站中的“反梯度”功能，设定延迟时间为0.5 min，流速0.3 mL/min，补偿泵流动相与分析泵流动相在色谱柱后三通相接，混合后进入电雾式检测器进行定量分析，雾化器温度50 ℃，柱温箱温度35 ℃，进样量3μL，理论塔板数按贝母素甲计不低于4000，结果见图1。

2.4 线性关系考察 分别精密移取“2.1”项下贝母素甲对照品溶液(1.4710 mg/mL)、贝母素乙对照品溶液(1.4225 mg/mL)各0.2、0.5、1、2、4 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成标准工作曲线溶液。按照2.1项下色谱条件检测，以质量浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归。求得贝母素甲回归方程：Y= 23.3914X+0.5806，r= 0.9992，在0.0294～0.5884 mg/mL范围内呈良好的线性关系。求得贝母素乙回归方程：Y= 23.5288X+0.5429，r= 0.9991，在0.0284～0.5690 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果贝母素甲和贝母素乙峰面积RSD分别为0.5%、0.4%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批号样品(批号：150827)各6份，每份 1 g，按“2. 1. 2”项下方法制备供试品溶液，按“2. 3”项下色谱条件平行试验，结果贝母素甲和贝母素乙的平均含量分别为0.673 mg/g和0.453 mg/g，RSD分别为2.5%和2.1%。

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0、2、4、8、16 h依法测定。结果贝母素甲和贝母素乙对照峰面积的RSD为1.5%、1.6%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 称取已测定的同批号样品(批号为150827)9 份，每份约0.5 g，精密称定，分别精密加入贝母素甲与贝母素乙贮备液0.1、0.2、0.3 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，结果贝母素甲三个水平的平均回收率在97.23%～100.90%之间，RSD为1.89%；贝母素乙三个水平的平均回收率在96.32%～98.75%之间，RSD为1.39%。

2.9 样品的测定 取各批次样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项色谱条件下进行测定，记录峰面积，计算含量，结果见表1，结果表明，药典方法与ASE方法结果RAD在0.8%～3.4%之间，两个方法间差异不大，但ASE方法实验过程耗时仅20 min，在效率上有很大优势。

表1 方法含量对比

3 讨论

实验采用快速溶剂萃取法提取浙贝母中贝母素甲和贝母素乙与药典方法对比，其前处理时间仅为药典的1/8，在效率上有较大的提升，另外在实验操作上释放了人力，降低了人为因素对实验结果的影响。同时，在实验中采用柱后补偿技术进行有机相补偿，提高了重现性及响应因子的一致性，可用于在缺少对照品的情况下，作为贝母素甲和贝母素乙的相对测定。

实验建立了快速溶剂萃取-柱后补偿液相色谱结合电雾式检测器分析浙贝母中贝母素甲和贝母素乙的含量测定方法。经过线性、稳定性、重复性、精密度和加样回收等方法学考察，结果表明本方法准确度高，精密度、重复性较好，可作为浙贝母中母素甲和贝母素乙的含量测定方法。