星点设计-效应面法优选“扶正固本”方 最佳提取工艺

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1.西藏大学医学院药学系，西藏 拉萨 850000；2.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，也是导致人类死亡的主要原因之一[1]。目前，恶性肿瘤的治疗主要包括手术治疗、放射治疗和化学治疗，其中化疗作为一种全身治疗方式能够在局部或全身减轻肿瘤细胞负荷[2]。临床中肿瘤发生、发展等同机体免疫功能密切相关，肿瘤化疗过程中由于化疗药物体内选择性差，在杀伤肿瘤细胞时会损伤免疫细胞，严重影响自身免疫系统抗肿瘤机制出现免疫抑制，对免疫功能进行调节就可抑制肿瘤细胞的生长和扩散[3]。与传统化疗药物相比，中药在抗癌方面具有安全高效、毒副作用小的优点，因此被广泛用于防治恶性肿瘤[4]。“扶正固本”是中医治病的主要治则之一，可以减轻化疗药物所导致的机体免疫功能损伤。经现代医学的研究证实：“扶正固本”法是对机体的免疫功能进行调节，利于淋巴细胞的增殖和促进网状内皮系统的活力进而增强机体的抵抗力[5]。恶性肿瘤在中医学中称为“积证”、“瘿病”等。《医宗必读》中记载：“积之成也，正气不足，而后邪气踞之”，表明正气亏虚是恶性肿瘤发生、发展的根本原因。传统中医理论认为扶助正气，稳固本源能够达到“正气存内、邪不可侵”的目的[6]。为了充分发挥中医药在肿瘤治疗过程中的优势，研究中选取了由人参、黄芪、茯苓等七味中药组成的“扶正固本”方。并对其提取工艺进行优选，为其进一步研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV-3010型紫外可见分光光度计(日本东芝公司)，Sartorius CP225D型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，B-220恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)，DZF型真空干燥箱(北京市永光明医疗仪器有限公司)，RE53CS型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 D(+)无水葡萄糖(D0806AS，美仑生物)，药材购自安国药材市场经鉴定符合《中国药典》2015年版一部的规定，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

“扶正固本”方由人参、黄芪、茯苓、白术、五味子、泽泻、炙甘草七味药组成。经查阅文献发现多糖为扶正固本方的主要活性成分，因此采用水煎煮法提取，实验采用星点试验-效应面法，以总多糖含量和出膏率的综合评分为评价指标，考察提取时间、提取次数及加水量对实验结果的影响。

2.1 多糖的含量测定[7]

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取无水葡萄糖对照品50.00 mg，置50 mL的容量瓶中，加水定容，制成1.00 mg/mL的葡萄糖对照品储备溶液。

2.1.2 5%苯酚溶液的制备 精密量取80 ℃熔化的苯酚溶液5 mL，至100 mL棕色容量瓶中，加蒸馏水至100 mL，摇匀。4℃冷藏，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 取处方量药材，按照设计方案加水提取，绢布过滤，定容到600 mL。取定容液5 mL，3500 r离心5 min，取上清1 mL，加95%乙醇5 mL，混匀静置4 h，3500 r离心15 min，沉淀加10 mL水溶解，取1 mL加水定容至5 mL即得供试品溶液。精密量取供试品溶液2 mL，加5%苯酚溶液1 mL 摇匀，迅速加入5.0 mL浓硫酸振摇5 min，90 ℃加热15 min，室温冷却30 min，490 nm波长处测定吸光度。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取葡萄糖标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2、2.5 mL分别置于50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。制备浓度分别为0.0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。精密量取上述各溶液2 mL，加5%苯酚溶液1 mL摇匀，迅速加入5.0 mL浓硫酸振摇5 min，90 ℃加热15 min，室温冷却30 min，490 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。经计算得线性回归方程为，y=20.563x+0.2071(r=0.9992，n=6)无水葡萄糖在0.0～0.05 mg/mL范围内具有良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 取质量浓度为0.02 mg/mL的葡萄糖对照品溶液按照“2.1.4”项实验方法，连续测定5次。结果显示葡萄糖溶液吸光度值的RSD=0.075%(n=5)。表明仪器的精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取同一供试品溶液，平行操作6份，按照“2.1.4”项实验方法测定吸光度值，结果显示吸光度值的RSD=0.105%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12、24 h后，“2.1.4”项实验方法测定吸光度值。结果吸光度值的RSD=0.097%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.8 加样回收率 精密称取供试品溶液5 mL，分别加入质量浓度为0.02 mg/mL的对照品溶液适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，“2.1.4”项实验方法测定吸光度值。计算加样回收率=97.26±0.45%。

2.2 出膏率测定 精密量取提取液75 mL置蒸发皿中，80℃水浴蒸干，干燥箱105℃干燥至恒重，室温下置干燥器中冷却30 min，精密称定重量，计算干浸膏得率。

2.3 星点实验设计

2.3.1 因素水平表选择 提取时间(A)、提取次数(B)以及加水量(C)3个因素作为本研究的考察对象，并确定其用量范围为：A：1～2，B：1～3，C：8～12。采用效应面法可连续的对实验的各个水平进行分析。以出膏率(Y1)、含糖量(Y2)、综合评分(Y3)作为测定指标进行实验考察。实验设计见表1。

表 1 设计实验因素水平及编码

2.3.2星点方案及结果 实验方案及结果见表2。

表 2 实验方案及结果

表3 二次回归模型的方差分析结果

注：*P<0.05模型或考察因素有显著影响；**P<0.01模型或考察因素有极显著影响；NS>0.05。

2.3.3 拟合模型的建立 采用Design-Expert 8.0.6.1统计软件对实验结果进行分析处理，以综合评分Y3为因变量，得二次多项式拟合方程。Y3=-1.98097+0.095825A+0.31370B+0.39804C+0.075850AB-0.00175AC-0.0082625BC-0.057200A2-0.034525B2-0.018237C2(r=0.9728，P<0.01)对上述拟合模型进行显著性检验，结果见表3。实验结果可见，实验模型有很高的显著性(P<0.01)。其中一次项B对Y3影响显著(P<0.01)，二次项中C2对Y3有显著影响(P<0.05)；一次项A、C，二次项A2、B2及交互项对Y3的影响不显著(P>0.05)。r=0.9728，说明模型能够很好地反映响应值的变化，可以用此模型来分析和预测扶正固本方的最佳提取工艺。

2.3.4 响应面结果分析及最佳处方的确定 利用Design-Expert V8.0.6.1软件，当将1个因素的编码值设定为0时，另外2个因素与响应值包封率的三维响应面图自动生成，结果如图2所示。在等高线图中，圆心的位置为极值条件出现的位置，等高线图越趋近于圆形，越说明此时的两个因素之间的相互作用对包封率的影响越大。越接近圆心位置，其综合评分的值越大。图2清晰的表明了B对包封率的影响最大。等高线图越扁平，表示因素之间的相互影响越小，A、C两因素之间的影响最小。在规定的提取时间、次数、加水量的范围内，实验结果的最优最佳处方为提取时间2 h，加10倍量水，提取3次。

2.3.5 验证实验 根据效应面法优选出的结果制备3批供试品，并对3批样品的多糖含量及出膏率进行测定。表4结果显示，根据星点设计-效应面法优选出的提取方法提取，综合评分Y3=0.8751%，将最优处方代入拟合方程得出Y3=0.9415，真实值与预测值接近，说明此方法可行。

表 4 验证实验

3 讨论

扶正固本方由人参、黄芪、茯苓、白术、五味子、泽泻、炙甘草七味药组成。以人参为君，大补元气。臣以黄芪入脾经而补中气，固表气，炙甘草补脾和中，三药相配可大补一身之气；五味子酸温收敛，入肾而滋肾水，固下焦，收耗散之气，配人参一补一敛，益气养阴，补敛合法；佐以泽泻利湿泄浊，浊得以泄，清得以存；脾胃气虚，运化失常，故佐以白术健脾燥湿，既助参芪补脾胃之气，又增强脾之运化，以助后天生化之源，更以其苦燥之性，燥湿以利健脾；脾主运化水湿，脾胃既虚，则湿浊易于停滞，故佐以茯苓，其味甘以健脾，淡以渗湿，使邪去而正气得复。

星点设计-效应面法一种新型的实验设计方法，集数学和统计学方法于一体，具有试验次数少、试验精度高、可连续对实验各水平进行分析等特点[8]。研究采用星点设计-效应面法，通过二项式拟合描绘了三维响应面，所得二项式复相关系数r=0.9728，表明采用此法优化扶正固本方提取工艺确实可行。通过响应面效果图可清晰了解影响提取效果的3个因素的效应趋势。从效果图可见，影响提取效果的各因素关系是：提取次数>提取时间>加水量。考虑到实验的可行性，结合效应面法优化结果将提取工艺确定为提取时间2 h，加10倍量水，提取3次。