桂枝茯苓丸对脐血来源树突状细胞分化、成熟 及免疫活性的影响

贵阳中医学院解剖学教研室，贵州 贵阳 550025

桂枝茯苓丸(Gui Zhi Fu Ling Pills，GZFLP)具活血化瘀、消癥散结之功，常用于治疗瘀阻胞宫证。药理研究表明，桂枝茯苓丸具有一定的抑瘤作用，其作用机理与调节机体免疫功能的作用密切相关[1]。机体内存在多种免疫监视机制，发挥着重要的抗肿瘤作用。而免疫活性细胞的致敏、激活和扩增又依赖于抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)呈递相应的抗原多肽和共刺激信号。树突状细胞(dendrititc cell，DC)是机体内最强的APC，它能激活T细胞，在诱导免疫应答中起着重要作用[2]。DC在人外周血中含量较少，因此，寻找体外合适的DC前体细胞并诱导分化其成熟以获得足够多的DC是DC抗肿瘤治疗的关键因素。本实验以人脐血作为DC前体细胞来源，采用桂枝茯苓丸体外诱导培养，旨在进一步研究桂枝茯苓丸抗肿瘤的机制，为中医药防治肿瘤提供一定依据。

1 仪器材料

1.1 脐血 在无菌下，采集健康足月妊娠产妇脐血100 mL/份，肝素抗凝。

1.2 药物 桂枝茯苓丸(桂枝10 g、茯苓10 g、牡丹皮10 g、赤芍10 g、桃仁10 g)购自贵阳中医学院第一附属医院中药药房，加适量水，浸泡2 h，先武火后文火煎煮2次，经过滤除渣后，水浴浓缩成1 g/mL中药水煎液，调pH值至7.0，经0.22 μm微孔过滤器过滤除菌，放4 ℃冰箱保存[3]。

1.3 试剂 RPMI1640培养液(美国GIBCO公司)；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF，美国Pepro Tech公司))；IL-4试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；鼠抗人CD80、CD40、CD83和CD86(北京中杉金桥生物技术有限公司)；抗β-Actin单克隆抗体(北京康为生物技术有限公司)。

1.4 仪器 CJ-1D超净工作台(天津泰斯特公司)；CO2恒温培养箱(美国Napco公司)；电控恒温水浴箱(北京长安科学仪器厂)；LD4-2A型离心机(上海医用分析仪器厂)； 电子天平(德国OHAUS公司)；倒置相差显微镜(日本尼康公司)；病理图像分析系统(Motic Med CMIAS)；Mini Trans-Blot型蛋白转印系统(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 脐血单核细胞的获取 在无菌条件下，取新鲜脐血(肝素抗凝)9 mL，加入1倍体积的无血清RPMI1640培养液稀释，吹打混匀后2∶1叠加于淋巴细胞分离液层(淋巴细胞分离液与稀释浓缩脐血比为1∶2)，经密度梯度离心(20 ℃，2000 r/min，20 min)，离心后分为血清层、单个核细胞层(白膜层)、淋巴细胞分离液层和红细胞层，小心吸取白细胞层，即为脐血单个核细胞，用RPMI1640培养液离心洗3次，每次1500 r/min，10 min，去除上清，用含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液重悬细胞沉淀，加入至75 cm2培养瓶中培养3 h，收集贴壁的单核细胞进行体外培养。

2.2 体外培养及倒置相差显微镜观察(采用6孔板，每孔2 mL) 将获取的单核细胞分为4组即空白对照组、细胞因子组(GM-CSF+IL-4)、桂枝茯苓丸组(GZFLP)、桂枝茯苓丸+细胞因子组(GZFLP+GM-CSF+IL-4)进行体外培养。各组取1 mL细胞悬液和1 mL10%胎牛血清，其中细胞因子组加入100 ng/mL GM-CSF20 μL及50 ng/mL的IL-4 20 μL，桂枝茯苓丸组加入1 mL100 μg/mL桂枝茯苓丸中药液，桂枝茯苓丸+细胞因子组分别加入1 mL100 μg/mL桂枝茯苓丸中药液及100 ng/mLGM-CSF20μL+50 ng/mL的IL-420 μL。各组均置37 ℃、5%CO2培养箱内培养10 d，每日在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状态，重点观察未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞的形态结构特征。

1.2.3 瑞氏-吉姆萨染色法 取无菌24孔培养板,每孔加入多聚赖氨酸溶液包被、烘干、每孔用PBS清洗3次、吹干，收集各组树突状细胞、经PBS清洗用含10%胎牛血清RPMI1640培养液重悬细胞、入37 ℃、5%CO2培养箱培养1 h使细胞贴壁，细胞贴壁后去除完全培养基，再用PBS清洗3次，之后每孔加入4%多聚甲醛固定液固定20 min，去除多聚甲醛残余液，使用瑞氏-吉姆萨染色液试剂盒进行细胞染色、镜下观察。

2.4 Western Blot法检测 依据细胞膜蛋白抽提试剂盒说明提取膜蛋白，依据BCA蛋白定量试剂盒说明测定蛋白浓度，根据SDS-PAGE凝胶制备试剂盒灌胶和电泳，然后进行转膜，按WB(HRP)试剂盒加入目的蛋白CD80、CD40、CD83、CD86染色，将化学发光检测底物工作液滴在印迹膜上，在暗室中将X光片置于膜上曝光，定影至胶片透明，风干备用。

2.5 T细胞获取和鉴定 取同种异体脐血，按上述方法获得单核细胞，取非贴壁细胞即为淋巴细胞，将3×107/mL的淋巴细胞注入尼龙毛柱，放入37 ℃，5%CO2恒温培养箱静置1 h。用预温的37 ℃含20%小牛血清RPMI1640培养液洗柱，洗下的即为T细胞。取T细胞进行涂片，丙酮固定10 min，免疫细胞化学染色显示细胞呈CD3+亚型、CD20-型。将剩余T细胞放入上述培养液中，并加入细胞因子人白细胞介素2(rhIL-2)500 μL，于37 ℃，5%CO2饱和湿度条件下培养待用。

2.6 MTT法检测T细胞的增殖 将实验各组DC用丝裂霉素C(25 μg/mL)处理后作为刺激细胞，取获得的T细胞作为反应细胞。按1∶10、1∶50、1∶100的比例分别加刺激细胞及反应细胞于96孔培养板中。每组3个复孔，其中T细胞为2×105/孔于37 ℃，5%CO2培养4 d，每孔加入MTT20 μL继续培养3 h，离心，弃上清，每孔加入DMSO150 μL，振荡10 Min，用酶标仪检测D570值，结果用3个复孔平均值计算。

3 结果

3.1 单核细胞形态 单核细胞呈圆形、贴壁生长、表面光滑、细胞核呈圆形、位于细胞中央。

3.2 倒置显微镜观察各组DC结果 培养第1天，可见细胞小、均匀散在分布；第2天时，细胞大部分贴壁，有少量悬浮；第3天时细胞悬浮成簇，第7天时，各组悬浮细胞增多，体积增大；第12天时，细胞表面出现突起。镜下观察发现，桂枝茯苓丸+细胞因子组DC数量最多，细胞因子组DC数量比桂枝茯苓丸+细胞因子组少、但比桂枝茯苓丸组多，空白对照组DC数量最少。如图1所示。

3.3 瑞氏-吉姆萨染色结果 培养5 d后观察发现，各组细胞大小不一，胞质呈蓝紫色、细胞核多为圆形、未成熟DC细胞内有大量囊泡，细胞表面突起短而少；而成熟DC细胞内囊泡少，表面突起多而长。桂枝茯苓丸+细胞因子组DC数量最多，桂枝茯苓丸组DC数量比桂枝茯苓丸+细胞因子组少、与细胞因子组比较差异无统计学意义(P<0.05)，空白对照组DC数量最少。如图2所示。

3.4 Western Blot法检测 未成熟DC的CD80、CD40、CD83、CD86蛋白表达见表1，成熟DC的CD80、CD40、CD83、CD86蛋白表达。见表2。

分组空白对照组因子组桂枝茯苓丸组桂枝茯苓丸+因子组 CD80/β-Actin0.069±0.0150.135±0.0180.115±0.0160.187±0.013∗CD40/β-Actin0.056±0.0180.129±0.090.116±0.080.156±0.04∗CD83/β-Actin0.0046±0.00310.0214±0.00210.0192±0.00150.0207±0.0014∗CD86/β-Actin0.056±0.0040.140±0.0070.153±0.0080.188±0.005∗

注：桂枝茯苓丸+因子组与其它组比较，*P<0.05。

分组空白对照组因子组桂枝茯苓丸组 桂枝茯苓丸+因子组CD80/β-Actin0.071±0.009 0.1921±0.00860.1878±0.01170.2141±0.0084∗CD40/β-Actin0.061±0.034 0.927±0.040.884±0.0441.033±0.043∗CD83/β-Actin0.021±0.013 0.494±0.035 0.456±0.0420.725±0.034∗CD86/β-Actin0.062±0.034 0.917±0.049 0.912±0.0421.032±0.043∗

注：桂枝茯苓丸+因子组与其它组比较，*P<0.05。

3.5 对T细胞增殖的影响 见表3。

分组空白对照组因子组桂枝茯苓丸组桂枝茯苓丸+因子组1∶100.123±0.0120.654±0.0620.717±0.071 0.890±0.072∗1∶500.095±0.0210.475±0.0370.493±0.042 0.569±0.039∗1∶1000.074±0.0230.376±0.0250.327±0.039 0.353±0.041∗

注：桂枝茯苓丸+因子组与其它组比较，*P<0.05。

4 讨论

现代免疫学认为,机体的免疫力与疾病的发生密切相关。《内经》“正气存内，邪不可干，邪之所凑，其气必虚”。祖国医学的正气即人体的免疫力，它的物质基础是天然免疫与获得性免疫的免疫活性物质[4]。T细胞参与机体的细胞免疫，它具有识别异己、保护机体的免疫调节作用。随着肿瘤病人的增多，研究肿瘤疫苗已经成为当务之急。T细胞是机体免疫反应的介导者，它的功能活动受到DC的监控。在抗肿瘤中，DC是目前已知的体内功能最强的抗原呈递细胞，抗原的识别、摄取、加工、提呈及T细胞的致敏、激活和扩增均依赖于抗原呈递细胞的参与和调节，因此，DC可以启动机体免疫反应。研究证实，DC激发T细胞增殖及抗原提呈能力是巨噬细胞和B细胞的100～1000倍，在抗原特异性细胞毒性T细胞为主的肿瘤过继免疫治疗中起着十分重要的作用。在合适的细胞因子组合下，能够在体外利用脐血成功诱导出成熟DC[5]。

目前，已发现多种可诱导DC成熟的刺激因子，如TNF-α、LPS、CD40L等[6]，但有一定的细胞毒性或功能尚未明确而限制了它们的应用。中医药在防治肿瘤方面有较大的优势。尤其是中药复方可针对肿瘤发病多因素的特点，因此，寻找中药复方替代细胞因子诱导DC成熟迫在眉睫。

桂枝茯苓丸出自张仲景《金匮要略》，该方由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、芍药5味中药组成，具有活血化瘀、消癥散结之功效，常用于治疗妇科瘀阻胞宫证。中医学认为血瘀是导致肿瘤的主要病因之一，大量临床实践证明，桂枝茯苓丸广泛用于各种血瘀症的治疗[7]，在治疗妇科肿瘤方面取得了可靠的疗效。现代药理学表明，桂枝茯苓丸具有一定的抑瘤作用，该方的抑瘤作用机理与其对机体免疫功能的调节作用密切相关。据报道，桂枝茯苓丸能促进免疫功能低下荷瘤机体分泌细胞因子，有效杀伤肿瘤细胞[8]。另有研究表明，桂枝茯苓丸的抗肿瘤作用机制和诱导肿瘤细胞凋亡有关，通过影响肿瘤细胞Survivin、p21waf/cip等基因发挥抑瘤作用[9]。本研究将桂枝茯苓丸制备成1 g/mL中药水煎液，调pH值至7.0，经0.22 μm微孔过滤器过滤除菌，能够在除菌的同时充分保留其药理活性。然而，目前对桂枝茯苓丸抑瘤机理的研究还待进一步深入，其是否能通过诱导单核细胞分化成熟为DC，激活T细胞增殖，增强机体抗肿瘤作用，还未曾报道。

研究经脐血单核细胞为前体细胞，以具有免疫、抗肿瘤作用的桂枝茯苓丸为诱导剂，探讨桂枝茯苓丸体外对人脐血单核细胞来源树突状细胞的分化、成熟及免疫活性的影响，并探讨其作用机制。结果显示，各组单核细胞体外培养均可诱导为树突状细胞，表现为细胞体积增大，形态不规则，细胞表面有较多的树突状突起，有很强的促T细胞增殖能力。各组细胞表面标志物蛋白(CD80、CD40、CD83、CD86)随树突状细胞成熟表达增强，尤以桂枝茯苓丸+细胞因子组诱导的树突状细胞多、表达强(P<0.05)、形态学特征更为明显；诱导T细胞的增殖能力强(P<0.05)。研究结果提示，桂枝茯苓丸可促进人脐血单核细胞来源的树突状细胞分化、成熟、增强树突状细胞的免疫活性，并与细胞因子协同作用效果更佳。然而，桂枝茯苓丸诱导脐血单核细胞分化为树突状细胞的物质基础还需进一步研究，不同浓度的桂枝茯苓丸诱导人脐血单核细胞分化为树突状细胞的效果的研究还需进一步深入。此外，采用流式细胞技术对树突状细胞表面蛋白的检测、细胞周期的观察是本课题下一步研究的重点。