泡球蚴感染C57BL/6小鼠肝脏CD34表达的动态变化

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泡状棘球蚴病(AE)简称泡球蚴病，是由多房棘球绦虫的幼虫寄生于人体从而引发的一种罕见的人畜共患寄生虫病，主要侵犯在肝脏[1-2]。泡球蚴主要通过直接侵蚀、炎症刺激、机械性挤压等方式损害肝组织，以外生性出芽增殖的方式长出新囊泡，然后长入组织内部并最终逐渐波及整个肝脏[3]。Hanahan[4]等研究发现，在肿瘤血管新生过程中会受到“血管生成开关”的调节。CD34是一种高度糖基化跨膜细胞表面的糖蛋白，可通过造血干细胞和祖细胞表达[5]，是血管内皮标记物中标记肿瘤新生血管的指标，具有稳定性和敏感性好的特点[6]。CD34具有血管新生和迁移的生物学功能，因此，被称为“泛血管内皮细胞标记物”，微血管密度(MVD)是研究肿瘤血管新生常见的指标之一。本研究通过检测CD34-MVD的表达及动态变化，初步探讨血管新生与泡球蚴病程发展的相关性，为以后临床治疗泡型包虫病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1动物与分组 实验用种鼠是人工腹腔感染原头节混悬液18周的子午沙鼠由新疆维吾尔自治区疾控中心提供，实验用健康清洁型的C57BL/6雌性小鼠，6～8周龄，体质量(18±2)g，购于新疆医科大学实验动物中心。运用数字表法将小鼠随机分成两组：实验组20只，对照组20只。

1.2主要试剂与仪器 CD34兔抗单克隆抗体购于英国Abcam公司，即用型免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物公司，二氨基联苯胺(DAB)显色剂和抗体稀释液均购于丹麦Dako公司。组织自动包埋机(Leica EG1160)及石蜡切片机(Leica 2245)均来自德国Leica公司。光学显微镜(CX31RBSF)为日本Olympus公司产品，图像采集系统(ExwaveHAD)为日本SONY公司产品。

1.3建立模型及标本采集 将人工腹腔感染原头节混悬液18周的子午沙鼠快速处死，无菌操作并剖腹，取出腹腔中泡球蚴组织，选择光滑、成簇游离于腹腔或附着在肠系膜、肝表面等部位的泡球蚴组织。用生理盐水反复冲洗后，将病灶组织剪碎、研磨、过筛网，再用生理盐水反复漂洗，最终配成浓度为20%的原头节混悬液。用0.5%伊红染色见泡状棘球蚴原头节3～5个/视野，结构清晰，着色率<15%，加青霉素、链霉素注射液各250 u/mL，用于动物接种。将40只C57小鼠麻醉，酒精消毒上腹部皮肤，开腹约0.5 cm，肉眼直视下1号针头左肝叶穿刺，实验组注入0.1 mL原头节混悬液/只(约400只活的原头节)，对照组注入等量0.1 mL PBS溶液/只，丝线缝合后关闭腹腔，烤灯照射等待复苏，醒后先禁食12 h，然后恢复正常饮食，饲养于清洁级动物房。分别于感染后30 d、60 d、90 d、120 d每组随机取5只小鼠，实验组取病灶及病灶周围肝组织，对照组取相应部位肝组织。

1.4病理组织学观察 将上述组织标本置于10%的多聚甲醛溶液固定24～48 h后，梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡及石蜡包埋。5 m厚度连续切片。HE染色，光学显微镜下观察各标本组织病理学改变。

1.5免疫组织化学染色检测CD34的表达 将制备好的石蜡切片烤箱复温，脱蜡至水化，枸橼酸缓冲液(pH=6.0)高压修复10 min,自然冷却至室温。然后3%H2O2溶液室温孵育10 min,1×PBS振洗(5 min×3次)，每个标本滴加约50 μL一抗稀释液(CD34工作浓度为1∶2 500)，4 ℃冰箱孵育过夜。次日温箱复温后1×PBS振洗(5 min×3次)，每张切片滴加约50 μL二抗稀释液，温箱孵育30 min后，1×PBS振洗(5 min×3次)，DAB显色，苏木素复染，酸酒精分化，自来水蓝化，脱水，透明，自然晾干切片后封片并做好标记。阴性对照用PBS替代一抗，阳性对照用人乳腺癌组织。

2 结 果

2.1肝脏大体观察 小鼠感染泡球蚴后，30 d时可见直径约3 mm的乳白色结节状泡球蚴组织，形态不规则；60 d泡球蚴体积略有增大，在肝叶边缘生长；90 d时一侧肝叶和第一肝门脏面两处可见明显的不规则的长条状组织；120 d时，泡球蚴组织较之前明显增长，并向肝组织内部不断渗入，呈浸润性生长，表现为结节性或巨块型。对照组小鼠肝脏无明显改变。

图1 不同时间点小鼠肝脏泡球蚴感染情况 (黑色箭头所指为泡球蚴组织)Fig.1 Infection conditions of different time points in Em-infected livers of mice (The black arrows indicated Em tissues)

2.2病理组织学 HE染色显示实验组小鼠感染泡球蚴30 d后出现外周炎性反应增生带，伴有嗜酸性粒细胞浸润、结核样肉芽组织形成和纤维组织增生，并可见数个原头节；感染60 d可见炎性细胞浸润逐渐加重，外周区域增生较为活跃，向周围肝组织侵蚀，肝脏原有组织结构部分被破坏；感染90 d时炎性反应增生带不断扩增，炎性细胞浸润愈加严重，出现与淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞和嗜酸性粒细胞等炎性浸润相关的细胞增殖；感染120 d后可见泡球蚴纤维囊壁形成，囊壁周围可见大量的炎性反应增生和肉芽肿组织，直径约1 cm的坏死空囊腔已形成，外周炎性增生带进一步蔓延，肝脏病理性改变严重。对照组小鼠肝组织结构基本完整，肝细胞形态正常，偶可见少量炎性细胞浸润。

A:实验组，B：对照组

2.3免疫组织化学染色 在不同时间点，实验组肝泡球蚴病变组织中均可见CD34不同程度的表达，阳性定位于泡球蚴组织内皮细胞的包浆。随着感染时间的延长，实验组泡球蚴组织CD34的表达呈时间相关性，表现为先升高后下降的趋势，在90 d时CD34-MVD最高，各时间点比较差异有统计学意义(F=94.63,P<0.001)。在泡球蚴周围肝组织中可见微量表达，差异无统计学意义(F=3.24,P>0.05)，图A2示泡球蚴组织炎性反应带和周围肝组织交界区域，可形成明显的反差。在对照组中亦可见微量表达，组内比较无统计学差异(F=1.98,P>0.05)。泡球蚴组和泡球蚴周围组、对照组三组相比差异有统计学意义(P<0.01)，而泡球蚴周围组和对照组相比无统计学差异(P>0.05)。见表1。

A1:实验组Em组织；A2:实验组Em周围肝组织；B:对照组

表1 不同时间点不同肝组织CD34-MVD的表达情况(个Tab.1 Expression of CD34-MVD in different time points of different liver tissues

3 讨 论

泡状棘球蚴病又称为泡型包虫病,其生长方式除了直接浸润以外，还可通过血液循环、淋巴等途径转移至肺脏、脑等器官，危害极大，泡球蚴的转移方式类似恶性肿瘤，故有“虫癌”之称[3，8]。恶性肿瘤的生长离不开营养的支持，需要血管来输送，所以血管新生在肿瘤生长、侵袭及转移中起着重要作用[9]。

CD34是高度糖基化的I型跨膜蛋白，是其家族成员之中的一种单体表面蛋白，可作为检测MVD的首选标志物[10]。CD34被广泛认为是血管内皮祖细胞(EPCs)的标记物[11]， 而EPCs是促进血管新生的重要干细胞之一。Siemerink M J[12]等研究表明：mRNA分析显示CD34阳性的血管内皮细胞与血管新生和迁移等生物学功能有关；CD34阴性的血管内皮细胞主要与增殖相关，该结果说明CD34在血管新生中有促进作用。 Sarmadi S[13]等认为CD34可标记宫颈癌的MVD。另外，CD34+干细胞可促进血管新生[14]；张示杰[15]等研究结果显示：沙鼠肝泡球蚴组织中CD34-MVD存在不同程度的表达。

本研究结果显示，在小鼠肝脏感染泡球蚴后，随着时间延长，其病变部位CD34-MVD的表达高于泡球蚴周围肝组织和PBS对照组肝组织，且差异均有统计学意义,此结果表明在泡球蚴浸润性生长过程中血管新生可能是存在的，并且是不断变化的。通过对实验组泡球蚴组织内比较可知，随着病程的发展，CD34的表达水平有所不同。在感染早中期，泡球蚴组织内新生血管可能不断增加,在感染晚期，随着泡球蚴病程的发展，其病变部位CD34-MVD呈现降低趋势，并且在组织内部可见坏死组织和空囊泡，其原因可能与血管壁慢性炎症以及管壁内膜增厚导致的血流受阻有关，坏死原因可能是囊内毒素外溢、抗原抗体反应所造成的[16]。Dematteis S[17]、Wang J[18]等学者研究表明，在棘球蚴感染早期，Th1细胞占主导，淋巴细胞功能较强，对棘球蚴的生长和转移有抑制作用；到后期，Th2细胞占主导，淋巴细胞功能逐渐降低，细胞免疫反应受到抑制，故包虫可在体内生存，增殖速度加快。本实验研究泡球蚴生长变化与其基本符合，即早期增长相对缓慢，晚期增长较为迅速，但仍需大样本研究进一步证实。可见在感染中期(90d)是免疫过渡期，即为机体免疫应答由Th1细胞介导的细胞免疫转变为Th2细胞介导的体液免疫[19]。由上可知，泡球蚴在感染早期，可能由于新生血管的不断增加，有营养供应，但是由于Th1的作用较强，对其生长和转移有抑制作用，故虫体增长不明显；而在中晚期，Th2作用逐渐变强，宿主对其抑制作用减弱，虽然新生血管减少，但也能够维持虫体长期生长，同时肝脏大量分泌的TGF-β1促进肝纤维化后包裹虫体，有助于泡球蚴免疫逃逸[20]。

总之，本实验研究表明，小鼠肝泡球蚴感染病程中，CD34的表达呈先升高后降低趋势，并且在90d时达到峰值，这说明在泡球蚴生长过程中很可能伴随着血管新生，血管新生可能为其生长重要的机制之一,同时，MVD可能在泡球蚴病程中起着重要作用。本研究为临床泡型包虫病的抗血管化治疗奠定了基础。