基于RNA恒温扩增技术分析天津地区呼吸道感染住院儿童肺炎支原体感染的流行病学特点

， ， ， ，李超，，

支原体是介于细菌和病毒之间，无细胞壁并能够独立生存的最小微生物。肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，MP)是引起呼吸道感染的常见病原体，通过飞沫传播，儿童感染最为多见，可发生于各个年龄段，全年可见，其发病率与性别、年龄、季节、地区有一定相关性[1]。MP可引起急性上呼吸道感染、支气管炎和支气管肺炎(Mycoplasmapneumoniaepneumonia，MPP)以及溶血性贫血、脑膜炎、心肌炎、肾炎等肺外并发症。婴幼儿MPP起病急，病程长，病情重，表现为发热、剧咳、呼吸困难和喘憋等，但其临床表现不是十分典型，容易误诊，从而延误治疗。MPP占儿童肺炎的 10%～20%，流行年份可达30%[2-3]。在大于5岁的儿童中，MP引起超过40%的社区获得性肺炎。在每4～7年一次的MP流行中，由MP导致的社区获得性肺炎会成倍增加。轻型MP感染性疾病尤其是支气管炎比社区获得性肺炎多至少20倍，但近20%的MP感染无临床症状[4]。因此掌握儿童MP感染的流行病学特点，使用快速、准确、低成本的检测方法很有必要[5]。

基于实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，SAT)的MP-RNA检测直接以病原体特异性RNA为扩增靶标，使用M-MLV反转录酶、T7 RNA多聚酶和优化探针进行恒温扩增，具有无创、快速、操作简单及高诊断准确性等优点。目前SAT技术已应用于肺结核、泌尿生殖道沙眼衣原体和淋球菌等病原体的检测，亦见于少数对支原体检测的报道[6-7]，但上述报道均为方法学研究，目前尚无基于SAT技术的关于MP的流行病学报道。为了解天津地区MP流行病学特点，为临床诊断和治疗提供参考，本研究选取2016年5月-2018年5月在天津市儿童医院拟诊断为呼吸道感染的住院患儿1 782例，对其MP-RNA检测结果及其他临床资料进行比较分析，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1研究对象 选择2016年5月-2018年5月在天津市儿童医院拟诊断为呼吸道感染的住院患儿1 782例作为研究对象，其中男性患儿975例，女性患儿807例，男女比例1.21∶1.00，年龄在1月-16岁之间。全部病例标本均进行MP-RNA检测，其中560例同时进行MP-DNA检测。统计标本入选：以患儿首次入院首次检测的标本为准，如同时检测多种标本，以阳性标本为准。临床诊断标准依据《诸福棠实用儿科学》第八版[2]。

1.2试剂和仪器 试剂使用上海仁度生物科技有限公司的MP核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)和中山大学达安基因股份有限公司的MP核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)，仪器使用ABI Prism 7500荧光定量PCR仪。

1.3 标本处理与检测

1.3.1MP-RNA检测 RNA提取及反应体系配置：取新鲜肺泡灌洗液、咽拭子、痰液或胸腹水标本，肺泡灌洗液使用原标本，咽拭子中加入1 mL生理盐水浸泡混匀，痰液用4倍生理盐水稀释混匀，胸腹水使用原标本；取200 μL标本，先后加入200 μL裂解液和100 μL核酸提取液并依次混匀；阴阳性对照按使用说明书配置；60 ℃保温5 min，室温平衡10 min；使用磁珠分离装置分离磁珠并清洗两次；用40 μL扩增检测液与磁珠混匀，最后取30 μL混合液置于微量反映管中，60 ℃保温10 min，42 ℃保温5 min，完成提取。30 μL上述提取液中加入10 μL酶液组成40 μL最终反应体系。

反应程序设置：42 ℃ 1 min，40个循环；荧光素通道设定为F1(FAM)和F2(HEX或者VIC)，荧光信号每分钟收集一次。

阳性结果判定：F1通道Ct≤35且溶解曲线在64±5 ℃区间有吸收峰，F2通道有或者无数值的样本为阳性；F1通道35

1.3.2MP-DNA检测 DNA提取及反应体系配置：痰液用4倍生理盐水稀释混匀，4 ℃冰箱过夜，咽拭子中加入1.5 mL生理盐水浸泡混匀,4 ℃冰箱过夜，肺泡灌洗液和胸腹水使用原标本；取上述标本1 mL至1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心5 min；去上清，沉淀中加入50 μL DNA提取液充分混匀，100 ℃恒温处理10 min，12 000 r/min 离心5 min备用。阴阳性对照按使用说明书配置。40 μL MP PCR反应液、 3 μL Taq酶及2 μL样品处理上清液组成最终反应体系。

反应程序设置：93 ℃ 2 min；93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，10个循环；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，30个循环。

阳性结果判定：扩增曲线呈S型且Ct值<30,则结果为阳性。

2 结 果

2.1MP感染总体情况 本研究共检测拟诊断为呼吸道感染的住院患儿1 782例，MP-RNA结果为阳性者709例，总阳性率39.79%。同时进行MP-RNA和MP-DNA检测的患儿共560例，其中MP-RNA阳性者430例，阳性率为76.79%，MP-DNA阳性者450例，阳性率为80.36%。

2.2MP感染的性别差异 本研究中男性患儿MP检出率(指MP-RNA，下文未注明者均同)为36.62%(357/975),女性患儿MP检出率为43.63%(352/807)。女性患儿MP检出率高于男性患儿(表1)，两者差异有统计学意义(χ2=9.04，P<0.05)，可推测天津地区呼吸道感染住院患儿的MP整体检出率女性高于男性。

表1 MP感染的性别分布Tab.1 Gender distribution of MP infection

2.3不同年龄患儿MP检出率比较 本研究中男性患儿的平均年龄为(4.45±3.37)岁；女性患儿的平均年龄为(5.01±3.34)岁，两者平均年龄比较差异有统计学意义(t=3.54，P<0.05)，女性患儿年龄略高于男性。在不同年龄组分布方面，新生儿与婴儿组、幼儿组、学龄前期组和学龄期组患儿MP检出率分别为9.79%(32/328)、 26.28%(123/468)、48.08%(225/468)和63.51%(329/518)。不同年龄组MP检出率比较差异有统计学意义(χ2=294.25，P<0.05)，其中新生儿与婴儿组最低，学龄期组最高，MP检出率随着年龄的增大而增高(表2)。

表2 MP感染的年龄分布Tab.2 Age distribution of MP infection

2.4不同月份(季节/年份)MP检出率比较 天津地区MP感染全年可见，图1列出了2016年5月-2018年5月这一时期内不同月份(1-12月)呼吸道感染患儿的MP检出率，可以看出不同月份间MP检出率有很大不同，其中9月份最高，达64.52%，4月份最低，为18.47%。若依照季节对表中数据进行整理，我们可以得出，天津地区春(3-5月)、夏(6-8月)、秋(9-11月)、冬(1-2，12月)四季呼吸道感染患儿的MP检出率分别为23.15%(141/609)、31.65%(25/79)、59.50%(216/363)和44.73%(327/731)。秋季呼吸道感染患儿MP检出率明显高于其他季节，秋冬季MP检出率高于春夏季(χ2=114.70，P<0.05)。若按自然年划分，2016、2017和2018年度天津地区呼吸道感染患儿MP检出率分别为：55.27%(173/313)、50.58%(395/781)和20.49%(141/688)。

图1 天津地区不同月份呼吸道感染住院患儿MP感染率Fig.1 MP infection rate of hospitalized children with respiratory tract infection in Tianjin in different months

2.5标本类型对MP-RNA阳性率的影响 此研究中MP检测共有4种标本类型：肺泡灌洗液、痰液、咽拭子和胸腹水，其MP-RNA阳性率分别为77.89%(391/502)、20.38%(161/790)、32.15%(154/479)和27.27%(3/11)。不同标本类型间MP-RNA阳性率比较差异有统计学意义(χ2=440.78，P<0.05)，肺泡灌洗液MP-RNA阳性率明显高于其他标本类型(表3)。

表3 不同标本类型中MP-RNA阳性率 Tab.3 Positive rate of MP-RNA in different specimen types

2.6MP-RNA检测结果与MP-DNA检测结果的比较 为探究RNA检测与DNA检测在MP检测中不同，遂对本研究中同时进行MP-RNA检测和MP-DNA检测的560份标本的检测结果进行比较(表4)，两者具有较好的一致性(Kappa=0.704，P<0.001)，一致率为73.57%(412/560)；MP-RNA检测阳性率为76.79%(430/560)，低于MP-DNA检测阳性率(80.36%)(450/560)，且两者差异具有统计学意义(McNemar检验：P< 0.05)。

表4 MP-RNA和MP-DNA检测结果比较Tab.4 Text results comparison of MP-RNA and MP-DNA

3 讨 论

MP感染是一种全球感染性疾病，以呼吸道感染最常见，患者为主要的传染源，通过飞沫经呼吸道传播，尤其多见于儿童。MP感染与性别、年龄以及季节有一定关系，不同性别和年龄患儿的MP发病率情况在不同地区具有一定的一致性，而不同地区患儿的MP检出率则不尽相同[8]。

MP感染诊断中，血清特异性抗体检测是目前最常见的方法，以往儿童MP感染流行病学分析多使用此方法，但其缺陷在于较难鉴别急性感染或既往感染。近年来分子诊断技术广泛应用于MP诊断领域，包括常规PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR等。与血清学方法相比，PCR方法敏感度、特异性和可靠性更高，而且不受患儿免疫状态的影响，有利于MP感染的早期诊断[9]。MP-DNA(PCR)检测技术的不足之处在于其不依赖于MP的存活状态，阳性结果无法区分急性感染、无症状感染和感染后的持续携带状态，有研究显示，动态检测MP感染后其DNA持续携带的中位数时间为7周，个别可长达7个月之久[10-11]。作为RNA检测技术之一的SAT技术以特异性RNA为靶标，由于RNA在菌体中含量较高且只存在于活体菌株中，SAT技术可提高病原体检出的敏感度和特异性，能够即时反映病原体感染情况，使诊断具有更高的准确率，可作为检测病原体感染的可靠方法[12-13]。本次检测中有560份标本在进行MP-RNA检测的同时进行了MP-DNA检测，其中有56份标本的检测结果不同，当中18份标本的MP-DNA结果为阴性，而MP-RNA的结果为阳性；38份标本的MP-DNA结果为阳性，而MP-RNA结果为阴性。查阅这些病例的临床及血清学检测结果，发现前者标本多在疾病早期留存，而后者患儿多在住院前已进行过有针对性的抗生素治疗，前者血清学检测结果阳性率及抗体滴度亦明显低于后者，提示MP-DNA阴性而MP-RNA阳性者多见于早期MP感染患儿，而MP-DNA阳性且MP-RNA阴性者多见于疾病治疗后的恢复期。这些结果表明SAT技术比MP-DNA检测具有更高的灵敏度，更适合于早期诊断，亦更适用于MP感染后治疗和恢复情况的监测。

本研究基于SAT技术共检测住院呼吸道感染患儿1782例，MP-RNA结果阳性者709例，总阳性率39.79%。最近几年国内呼吸道感染患儿MP检出率中，东北地区有报道30.19%[14]，西北地区有报道30.79[15]，长江三角洲地区有报道20.97%[16]，西南地区有报道27.01%[17]，华北地区此前有报道27.23%[18]。比较上述各地区MP检出率，变化较大，但以此次天津地区MP检出率为最高，分析其原因，一方面检测方法不同，上述文献报道均使用血清学检测方法，而此次报道采用SAT技术；另一方面可能与标本类型有关，此次检测中肺泡灌洗液所占比例较大且其阳性率远高于其他类型标本，高达77.89%(391/502)(表3)；此外不能排除天津地区住院患儿MP感染(携带)率原本高于其他地区的可能性。目前国内外针对肺泡灌洗液的MP核酸检测尚少见，国外曾有研究者收集319例患有慢性呼吸系统疾病的患儿的肺泡灌洗液，并利用PCR方法检测其MP-DNA，结果显示10%的患儿MP-DNA阳性[19]，这与此次检测结果有一定差别，其中原因有待进一步研究。

以往报道中，不同性别间MP检出率差异不尽一致，到目前为止尚无明确证据表明MP感染存在性别差异。本次检测结果显示，男性患儿MP感率为36.63%，女性患儿MP感率为43.62%，女性高于男性,两者差异有统计学意义。MP感染可发生于儿童各年龄段，国内外报道均显示MP感染发病的高峰期为学龄前期和学龄期儿童[8,20]，本次检测结果显示，天津地区各年龄段呼吸道感染住院儿童MP检出率有显著差异，结果具有统计学意义，MP检出率随着年龄的增大而增大，学龄前期尤其是学龄期患儿MP检出率明显高于其他年龄组患儿，这与上述以往研究相一致。分析其原因，学龄期儿童走出家庭进入人员密集环境，一方面在适应的过程中免疫力下降，另一方面被传染的概率大大增加。

MP感染见于全年各个季节和月份，不同地区的高发季节并不相同。在国内MP检出率的问题上，以往观点多以南北方论，认为北方多发于冬春季，南方多发于夏秋季，但部分研究并不支持这一观点。地处我国北方的北京地区秋冬季MP检出率明显高于春夏季[21]，地处长江三角洲地区的南京以夏半年较多，其春夏季的MP检出率高于秋冬季[22]。而同属南方，位于珠江三角洲地区的广州的冬季的MP检出率高于其他季节[23]。研究显示MP感染与环境温度和湿度呈正相关，温度和湿度可能才是MP感染和致病的更直接因素，而非直接取决于地域或气候[24]。本次检测显示，天津地区呼吸道感染住院患儿MP检出率秋季最高，且秋冬季明显高于春夏季。这与上述北京地区研究结果基本一致。此外，MP感染每隔几年就会在大范围的区域内出现一次周期性流行，从2010年起，欧洲地区尤其是欧洲北部国家MP检出呈现上升趋势，同时期的其他地区如巴西、以色列、韩国和日本也出现流行[25]。从2011年至2013年，中国北方地区出现一次明显的MP感染流行，2014年至2016年MP感染又进入低潮期[26]。此次报道天津地区MP检出率呈整体下降趋势，周期性流行趋势有待更长时间的监测。

综上所述，RNA恒温扩增技术是检测MP感染的有效方法，具有较高的敏感度和准确率。天津地区呼吸道感染住院儿童MP总检出率为39.79%，女性患儿检出率高于男性；MP感染可发生在各年龄段儿童且会随着年龄的增大而增高，其中学龄期儿童MP检出率最高；MP感染见于全年，秋冬季MP检出率高于春夏季，秋季检出率明显高于其他季节。