水稻OsDUF393基因编辑突变体的创建

王荃 石雨鹭 邳瑞雪 孔晓聪 靳亚军 梁闪闪 张泗举 栾维江

（天津师范大学生命科学学院/天津市动植物抗性重点实验室，天津300387；第一作者：wanghanmada＠163．com；*通讯作者：lwjzsq＠163．com）

未知功能结构域蛋白家族（domains of unknown function protein families，DUFs）是一大群功能未知的蛋白家族。生物信息学分析发现，大约3 700多个未知功能结构域蛋白家族存在于蛋白家族（Pfam27．0版）数据库中，占据了整个蛋白家族的25%左右[1]。大量转录谱和蛋白谱分析显示，DUFs蛋白对生物的生长发育发挥着重要作用。对这些基因的研究将有助于对生物体复杂的生命活动进行更深入的了解[2]。在植物中，DUF家族成员的功能报道较少。目前已有的DUFs基因生物学功能研究主要集中在模式植物拟南芥和水稻中。根据已有研究发现，DUFs家族基因与植物的生长发育及非生物胁迫应答密切相关。在拟南芥中，DUF784家族基因能够调控花粉发育，利用RNAi技术降低拟南芥DUF784家族基因的表达水平，在RNAi转基因株系中出现胚珠败育的表型[3]。DUF579家族基因IRX15和IRX15-L参与半纤维木聚糖的合成，影响拟南芥次生细胞壁形成[4]。拟南芥DUF642家族基因DGR1和DGR2参与了拟南芥对抗坏血酸合成末端前体L－GalL的响应，并互补表达影响着拟南芥叶的扩展和根的伸长[5]。拟南芥硫氧还蛋白DCC1属于DUF393家族，定位于线粒体中，在愈伤组织中表达较高。它可以通过氧化还原调节ROS稳态平衡进而调节拟南芥的芽再生过程[6]。已报道的水稻DUF966家族成员OsDSR2的表达明显受到干旱、高盐等非生物胁迫条件的抑制[7]，该基因的过表达增强了水稻对PEG6000和高盐胁迫的敏感性。水稻DUF1644家族基因OsSIDP409的超量表达可以提高转基因植株的抗氧化胁迫能力，提高了植株的耐盐性[8]。水稻幼小花序和小穗的内外稃中DUF640家族基因BSG1强烈表达，它对水稻的内外稃发育、籽粒形状和大小都起着正调控作用[9]。

CRISPR/Cas9基因编辑技术已广泛的应用于基因功能研究中，通过该技术可以对基因组DNA进行编辑，创建突变体，从而进行基因功能的研究。1987年，日本大阪大学的实验室在研究大肠杆菌的碱性磷酸酶基因时发现该基因编码区下游存在一段串联间隔重复序列，该序列包括14个29 bp的重复片段和32～33 bp的间隔序列[10]。2002年，MOJICA等[11]将含有该特点的序列命名为Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）。2005年发现，这类重复结构广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，预测其来源是原核生物在进化过程中针对噬菌体等外源基因的获得性免疫防御机制[12]，该系统简称为CRISPR/Cas9系统。根据结构不同，CRISPR/Cas9系统分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3种不同类型[13]。现在最简单、应用最广泛的是Ⅱ型。该系统由3部分组成：Cas9核酸酶、前体crRNA（pre－crRNA）和反式激活 crRNA（tracrRNA）。tracrRNA与pre－crRNA的重复序列配对，引导pre－crRNA加工，生成crRNA－tracrRNA复合体。在前端20 bp靶点序列的引导下，Cas9蛋白特异切割目的序列。2013年，CONG等[14]首次报导该系统定点突变人类293T细胞EMX1和OPVALB基因及小鼠细胞的Th基因，其在基因组进行特异性切割。之后CRISPR/Cas9系统成功应用于家蚕、果蝇、酵母、斑马鱼等多个物种的内源基因定点编辑[15]。高彩霞等[16]利用CRISPR/Cas9系统实现了对水稻中OsPDS、OsBADH2、OsMPK2和Os02g23823等4个基因的定点突变，水稻转基因植株中的突变率为4．0%～9．4%，证明CRISPR/Cas9系统能够用于植物基因组编辑。后来众多科学家对该系统进行了优化，并高效用于水稻的基因编辑中[17－20]。

为了揭示水稻中DUF家族基因的功能，本文利用CRISPR/Cas9技术构建了水稻 DUF家族成员Os－DUF393的编辑载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法[21]，获得一系列稳定遗传的OsDUF393基因编辑突变体，并通过测序对其突变类型进行分析，为探究水稻OsDUF393基因功能提供研究材料。

1 材料与方法

1.1 材料

以粳稻品种中花11和转基因材料用于本实验。所有材料种植于天津师范大学试验田及海南陵水南繁基地，田间保持常规管理。

1.2 靶向编辑位点的引物设计

利用 NCBI（http://www．ncbi．nlm．nih．gov/）数据库查询OsDUF393基因及蛋白序列，并用E－CRISPR网络软件预测目的基因的打靶效率，在目的基因的编码区中查找符合GN（19）NGG的序列作为编辑的靶点。本实验在基因OsDUF393的第1个外显子和第2个外显子各设计1个靶点，并对设计的2个靶点进行BLAST比对，保证其特异性。2个靶点的引物序列为DUFC1F：5 "－GTGTGGCGAGCTCGCTGGCACGCA －3 "；DUFC1R：5 "－AAACTGCGTGCCAGCGAGCTCGCC －3 "；DUFC2F：5 "－GTGTGTTCACTCTGACGTCAAAGT －3 "；DUFC2R：5 "－AAACACTTTGACGTCAGAGTGAAC－3 "。

1.3 CRISPR/Cas9载体构建

将合成的正反向引物各取10 uL混至1个管，放入PCR仪中退火。将退火产物进行回收后与用BbsⅠ酶切的Os－U6SK质粒骨架过夜连接获得sgRNA重组载体，并对重组载体进行PCR鉴定，所用特异引物分别为：M13F与靶点序列下游引物 DUF393－C1R和M13F与靶序列下游引物DUF393－C2R。将获得的sgRNA融合载体及含有Cas9的Cas9－sk空载体分别用载体相应的限制性内切酶进行酶切，回收酶切产物并将其连接到pCAMBIA1300双元载体中，获得重组载体。

1.4 转基因植株的获得及分子鉴定

将构建的重组双元载体转入农杆菌，利用农杆菌介导的遗传转化方法获得转基因植株。待转基因植株移至大田，收集转基因植株叶片，用CTAB法提取水稻基因组DNA[22]，以载体中选择标记潮霉素特异性hygF/R引物对其进行PCR分子鉴定，引物序列为hygF：5 "－GGAGCATATACGCCCGGAGT－3 "；hygR：5 "－GTTTATC GGCACTTTGCATCG－3 "。

1.5 转基因植株的突变位点及测序分析

在目的基因靶位点上下游250 bp左右设计特异性检测引物，以转基因植株基因组DNA为模板进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳进行检测。对于测序分析，首先利用混池方法，将提取的转基因植株的DNA每5株混成1个样品，进行PCR扩增，PCR产物送至生物公司测序。根据测序结果，再将产生编辑的混池样品进行单株测序，利用在线软件DSDecode（http://dsdecode．scgene．com/）对突变位点进行解码，分析每株转基因植株的突变情况。所用引物序列为MA1F：5 "－TGCGGGCTAATCCAACGGTT －3 "，MA1R：5 "－CGATTA CCAGCAGGCAACAG －3 "；MA2F：5 "－CTCTGATGCGTT TGCCCATT－3 "，MA2R：5 "－TTGTCCCTTGCCACACCAG T－3 "。

1.6 基因的表达分析

对于目的基因的组织特异性表达分析，田间收集野生型不同组织器官，包括茎顶端分生组织、叶、根、茎和不同时期幼穗，提取总RNA，反转录获得cDNA，利用RT－PCR分析目的基因在不同组织器官中的特异性表达。对于编辑突变体的表达分析，提取T1代田间生长60 d的编辑突变体的叶片总RNA，利用M－MLV反转录酶进行反转录获得cDNA，用目的基因OsDUF393基因特异性引物进行RT－PCR表达分析，引物序列为TestF：5 "－ACTCTCCACAAGACAATCAG－3 "；TestR：5 "－ATCATCTTTGCATTCGGCTG－3 "。

图1 OsDUF393基因的结构及编辑位点设计

图2 OsDUF393基因CRISPR/Cas9编辑载体构建

图3 OsDUF393基因CRISPR-Cas9转基因植株的分子检测

2 结果与分析

2.1 OsDUF393序列分析及靶位点的选择

为了探索水稻基因OsDUF393的功能，用CRISPR/Cas9技术靶向编辑该基因的CDS序列。通过水稻基因组注释数据库（http://rice．plantbiology．msu．edu/）查询到OsDUF393基因的全长编码序列，含有8个外显子、7个内含子，编码1个209个氨基酸的蛋白质（图1）。对基因结构域进行分析，发现该基因隶属于DUF393家族。进一步分析OsDUF393基因序列发现，第3～8个外显子的序列较短且找不到合适的靶位点。利用在线软件E－CRISPR[23]在第1个及第2个外显子发现了效率高、特异性好的sgRNA靶位点。据此设计了2个靶向编辑位点，分别命名为 target 1（TG1）和 target 2（TG2）。

2.2 OsDUF393基因CRISPR/Cas9编辑载体的构建

根据上述靶点的设计，将经退火的引物连接至O－sU6－SK载体上，获得有OsDUF393特异识别的sgRNA融合载体，分别为 OsU6－SK－TG1 和 OsU6－SK－TG2。将载体热激转化至大肠杆菌中，挑取单克隆进行PCR鉴定，凝胶电泳结果证实扩增出的片段大小为400bp左右，与预期结果一致（图2－A），表明目的靶点已成功连入了OsU6－SK空载体。同时对连接成功的融合载体进行测序确认，结果表明，OsDUF393基因的靶序列已成功连接到了OsU6SK载体上。将构建好的融合载体OsU6－SK－TG1、OsU6－SK－TG2，含有 Cas9 的 35SCas9－SK载体及pCAMBIA1300双元载体，分别酶切回收，将回收产物进行三片段连接（图2－B），从而将带有特异靶点的sgRNA及Cas9表达盒共同构建到用于植物转化的双元载体pCAMBIA1300中。将连接成功的重组载体进行质粒酶切鉴定，结果表明，重组载体切出了预期的目的片段，片段大小正确（图2－C），表明2个目的片段已成功连入了pCAMBIA1300空载体中。

2.3 转基因植株的获得和分子检测

通过农杆菌介导的遗传转化方法，将2个靶点（TG1和TG2）的双元载体分别导入野生型中花11中，最终获得3个line的TG1转基因植株30株，8个line的TG2转基因植株70株。经潮霉素抗性基因鉴定，100株转基因植株均为转基因阳性植株（图3）。

2.4 编辑突变体的突变位点分析

为了验证转基因植株中的目的基因OsDUF393是否被编辑，我们首先采用混池方法（BSA,bulked segregant analysis）进行检测，从转基因植株中提取基因组DNA，每5株DNA作为1个混池进行PCR扩增，然后将PCR产物纯化后进行测序分析。获得的30株TG1转基因植株共分为6组进行测序，编号为TG1－1～TG1－6；70株TG2转基因植株共分为14组进行测序，编号为 TG2－1～TG2－14。测序结果发现，TG1－3 和TG2－8出现套峰（图4）。测序结果峰图显示，套峰出现在PAM序列（该序列为NGG，N为任意碱基）附近，说明这2组混池中目的基因OsDUF393可能被编辑。

图4 转基因植株混池测序分析

图5 编辑突变体的测序分析及PCR验证

图6 OsDUF393基因的组织特异性表达

为了进一步验证突变位点，将TG1－3和TG2－8两组样品，即10个单株的PCR产物，单独测序。结果显示，TG1－3 中有 3 株发生突变，突变体编号为 1#、2#、3#。TG2－8中有1株发生突变，突变体编号为4#。对这4个突变体进行测序解码分析，发现1#编辑突变体是1个单碱基插入的杂合突变体，在PAM序列－4区插入了1个A碱基（图5A）。2#编辑突变体含有1个62 bp缺失的杂合突变体，PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，可以扩增出2条清晰的条带（图5B），对这2条带进行测序发现两者之间有62 bp缺失（图5B）。3#编辑突变体是1个纯合缺失突变体，PCR检测发现其产物比野生型小了41bp（图5C）。4#编辑突变体也是1个单碱基插入的杂合突变体，在PAM序列－2区插入了1个A碱基（图5D）。

2.5 OsDUF393基因在水稻中的组织特异性表达分析

为了进一步探究OsDUF393基因功能，利用RTPCR分析了目的基因在水稻不同器官中的表达情况。分别提取水稻茎顶端分生组织、叶、根、茎和不同时期幼穗的总RNA，反转录后进行表达分析。结果表明，OsDUF393主要在水稻叶片中表达，在其他组织器官中的表达非常微弱，很难检测到（图6），暗示了Os－DUF393是叶片特异表达的基因，可能在叶片的生长发育中具有重要的功能。

2.6 编辑突变体的表达分析

将上述1#～4#T0代编辑突变体（即转基因当代）获得的种子进行种植，分别获得T1代1#～4#的转基因株系，通过检测均获得了纯合编辑突变体。为了检测编辑突变体中OsDUF393的转录水平，提取1#～4#T1代转基因株系中纯合突变体单株的叶片RNA并经反转录获得cDNA。通过RT－PCR分析突变体中OsDUF393基因的表达水平，结果表明，目的基因在不同纯合编辑突变体中转录水平均有下降，2#纯合编辑突变体中表达量明显降低，在3#纯合编辑突变体中几乎不表达（图7－A、图7－B），表明编辑突变体中OsDUF393的转录受到影响。2#和3#纯合编辑突变体均为较大片段缺失突变体，可能对DNA序列及结构造成较大影响，目的基因OsDUF393转录水平受到影响较大。尤其3#突变体的41 bp碱基缺失是从目的基因的起始密码子开始，可能对OsDUF393的起始转录造成了较大影响，致使3#株系纯合编辑突变体不能检测到该基因的表达。1#和4#纯合编辑突变体为单碱基插入，可能对DNA序列及结构造成影响较小，因此目的基因OsDUF393转录水平受到的影响较小。

图7 纯合编辑突变体的表达检测

3 讨论与结论

未知功能结构域蛋白家族（DUFs）是一个有着众多家族成员的蛋白家族，不同DUFs基因具有不同的生物学功能。DUF393家族属于未知功能蛋白家族。一些研究初步表明，DUFs基因在逆境胁迫下诱导表达，参与了水稻对生物或非生物胁迫的响应。已报道Os－DUF500基因表达水平与水稻的白叶枯病抗性相关，利用RNAi技术敲降OsDUF500基因，在RNAi转基因株系中发现水稻株高变矮、叶片变短，出现白色空秕谷，对白叶枯病菌的抗性增强[24]。DUF761家族基因OsLCL3受低温强烈诱导，在低温胁迫下，过表达转基因植株的细胞膜表现出很强的稳定性，且存活率明显高于对照组，上调OsLCL3基因的表达水平能够增强植株的耐低温能力[25]。作为DUF蛋白家族中的一员，目前尚未有关于该家族基因生物学功能的报道。DUF393家族基因成员存在于许多植物中，如水稻、拟南芥、大豆、玉米及高粱等植物中均含有此家族成员基因。不同DUF393蛋白家族成员在蛋白序列上相似性较高，在其N端均存在2个高度保守的半胱氨酸残基。

本实验为了揭示OsDUF393基因在水稻生长发育中的功能，利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑水稻基因OsDUF393，获得了OsDUF393基因编辑突变体。实验结果显示，2个靶点均获得了不同类型的编辑突变体。而且编辑突变体的转录水平受到明显的影响，说明CRISPR/Cas9载体正常工作，可以获得预期突变体。拟南芥中与OsDUF393高度同源的基因—AT5G50100，编码1个DCC1蛋白，能够通过氧化还原调控ROS稳态，从而调节拟南芥的芽再生过程。而活性氧又与大多数植物的抗逆应答反应息息相关。OsDUF393的组织特异性表达分析表明，该基因在叶片中特异性表达。我们推测OsDUF393基因可能与水稻的非生物胁迫应答反应相关，后续我们将对OsDUF393的不同T2代纯合编辑突变体进行高盐、干旱、低温等非生物胁迫处理，从而探究该基因的功能。并用GUS融合表达载体分析其启动子活性及诱导表达；构建OsDUF393基因的GFP融合载体，探究该基因的亚细胞定位，精确研究该基因功能。