探讨一种新型Wnt替代蛋白激活脑血管Wnt信号通路对血脑屏障的保护作用

曾 毅， 荣先芳， 方 程， 尹美芳， 梁 迅， 畅君雷

脑卒中是由于脑血管突然堵塞或者破裂导致局部脑组织血液供应障碍所致的一种急性脑疾病，其中超过75%为缺血性脑卒中[1]。脑血管除了输送血液、供给养分外，还具有特殊的“血脑屏障”(Blood-Brain Barrier，BBB)功能。血脑屏障高度选择性的输送血液中的有益成分进入脑组织，而限制血液中的有害物质通过，从而保持脑组织微环境的稳定和中枢神经系统的正常功能[2]。研究表明，在缺血性脑卒中发生时脑血管受到缺血再灌注损伤，血脑屏障遭到破坏，血液中的有害成分，比如炎性因子和免疫细胞，进入脑组织中加剧脑组织损伤[3]。Wnt是一类分泌性糖蛋白，通过与其受体FZD和LRP5/6结合，诱导依赖于β-catenin的信号通路(又叫经典Wnt信号通路)激活，进而调节多个生物过程，包括细胞生长、分化以及干细胞自我更新，调控细胞命运，促进多种组织的生长和修复[4，5]。Wnt/β-catenin信号通路在胚胎发育中对脑血管发育和血脑屏障形成起核心的调控作用，主要表现在以下三个方面：(1)内皮细胞Wnt/β-catenin信号通路功能的缺失特异性影响脑血管发育和血脑屏障功能，却并不影响其他器官和组织的血管发育和功能[6，7]；(2)在小鼠神经组织中敲除Wnt7a/7b[6，7]或者在内皮细胞中敲除Wnt的受体FZD4[8]、LRP5/6[9]、受体激活剂Gpr124[10～12]或者Ctnnb1(β-catenin)[13]，均可导致脑血管发育和血脑屏障功能异常；(3)在体外培养的内皮细胞中激活Wnt/β-catenin信号通路可以显著上调血脑屏障功能相关基因的表达[14]。我们前期研究发现，脑血管内皮细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性升高可显著保护缺血性脑卒中后小鼠的血脑屏障功能，并进而减少脑梗死体积、提高小鼠生存率[15]。

天然的Wnt蛋白由于侧链的棕榈油酸酯修饰，导致其水溶性差，难以表达纯化，极大地限制了Wnt蛋白的生物和医学应用[4]。斯坦福大学的Janda等学者研发出一种新型Wnt替代蛋白(Wnt surrogate，Wnt-S)，由FZD受体的中和抗体Vantictumab的单链可变区(scFv，single-chain variable fragment)和LRP5/6结合蛋白DKK1的C端区域连接而成，形成一个新的融合蛋白scFv-DKK1c[16]。Vantictumab的scFv部分能与FZD1，2，5，7，8高亲和力结合，而DKK1的C端区域能与LRP5/6结合，因而这种人工合成的Wnt-S蛋白可同时与FZD和LRP5/6结合并激活下游的Wnt/β-catenin信号通路，且易溶于水、容易表达纯化，在细胞实验和小鼠体内都显示出良好的生物功能。我们前期合成出Wnt-S的基因片段，通过分子克隆和蛋白表达纯化技术得到Wnt-S蛋白，探寻Wnt-S蛋白对人脑血管内皮细胞Wnt/β-catenin信号通路的作用。

1 材料和方法

1.1 细胞和主要试剂 HEK293细胞由北京大学深圳研究院赠送，HEK293F和hCMEC/D3细胞购自美国ATCC。限制性内切酶EcoRI和XbaI购自NEB公司。感受态细胞和T4 DNA连接酶购自TaKaRa。LB培养基粉末(Thermo Fisher)，西班牙琼脂糖(BIOWEST)，无内毒素质粒大提试剂盒(TIANGEN)，PEI(Polysciences)，Ni SepharoseTM6 Fast Flow(GE Healthcare)，BCA蛋白定量试剂盒(Solarbio)，一抗稀释液(日本东洋纺)，ECL发光液(MILLIPORE)，His-Tag (D3I1O) XP®Rabbit mAb，Anti-rabbit IgGAlexa Fluor594 Conjugate和Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody(CST)，CD31抗体和VE-cadherin抗体，GLUT1抗体和MFSD2A抗体(Abcam)。DMEM高糖培养基和双抗(HyCloneTM)，澳洲胎牛血清和羊血清(Gibco)，Endothelial Cell Medium(ScienCell)，FreestyleTM293 Expression Medium(Invitrogen)。TRIzol Reagent(Life technologies)，Direct-zol RNA Miniprep(ZYMO RESEARCH)，反转录试剂盒和SYBR qPCR Mix(诺唯赞)。4%组织细胞固定液，Triton X-100，封片剂(含DAPI)(Solarbio)。

1.2 实验方法

1.2.1 分子克隆 将金唯智公司合成的Wnt-S in pUC57-Kan(Wnt-S基因片段两端有EcoRI和XbaI两个酶切位点)，用EcoRI和XbaI切下Wnt-S片段(具体方法参照NEB公司这两种酶的使用说明)，同样的方法切割pcDNA3.1 (+)载体，分别跑核酸凝胶电泳，紫外下切胶回收纯化目的基因片段Wnt-S(1189 bp)和pcDNA3.1 (+)载体(6.4 kb)，用T4 DNA连接酶连接目的片段和载体，再将连接好的质粒与感受态细胞做转化，均匀涂布在含氨苄青霉素的平板上，待长出菌落，挑取单克隆于2～5 ml 含氨苄抗性的LB液体培养基中，37 ℃，300RPM摇床上培养8 h，小提质粒，EcoRI和XbaI双酶切该质粒，核酸凝胶电泳验证，一条带大小在6.4 kb，另一条带大小在1.2 kb，再进行大提质粒。

1.2.2 细胞转染 转染前对HEK293F细胞进行计数，用20 ml PBS稀释质粒(400 μg)，小心混匀，记为A液，用20 ml PBS稀释PEI(800 μl)，小心混匀，记为B液(质粒：PEI=1∶2，W∶V)，室温静置5 min。将B液缓慢加入到A液中，用涡旋振荡器边加边振荡，室温静置20 min。将DNA-PEI混合液缓慢加入到360 ml FreestyleTM293 Expression培养基中，轻轻混匀，使细胞密度在0.8×106～1.2×106cells/ml，置于37 ℃，8% CO2，125 r/min细胞培养箱的水平摇床中培养。每天取少量培养基，检测细胞活度，待细胞活度接近70%时，停止培养，1000 r/min离心收集上清。

1.2.3 Wnt-S蛋白表达纯化 组装好恒流泵，将进液管插入平衡液中，出液管插入废液槽，往填料柱中加入0.5 ml Ni SepharoseTM6 Fast Flow，开启恒流泵，调节速率，使平衡液匀速流出。30 min后，将进液管插入含Wnt-S蛋白的上清中，出液管插入干净的收集瓶中，使液体匀速流过柱子，并且避免将填料冲起。此过程在4 ℃环境下进行，待上清全部流过柱子，再按上述同样的操作，将收集瓶中的液体再过一次柱子。用20 mmol/ml，40 mmol/ml，60 mmol/ml，80 mmol/ml，120 mmol/ml，160 mmol/ml咪唑(六种浓度的咪唑体积均为10 ml)依次洗脱柱子，并分别收集洗脱液，再将这些洗脱液分别加入10 kDa离心过滤器中，在4 ℃，4000 r/min，15 min条件下离心，浓缩后的液体即为Wnt-S蛋白溶液。

1.2.4 Western blot检测Wnt-S蛋白 BCA蛋白定量试剂盒检测样品的浓度，计算上样量。取一定量蛋白与5x蛋白上样缓冲液混匀，置于100 ℃金属浴中处理5～10 min，配制10%分离胶和5%浓缩胶，进行电泳。电泳条件：80 V，30 min，120 V直到溴酚蓝进入浓缩胶底部，停止电泳。转膜条件：300 mA，90 min。5%脱脂奶粉溶于TBST封闭1 h，用抗体稀释液稀释相应一抗，PVDF膜被一抗覆盖，置于4 ℃，摇床上过夜。TBST洗膜3次，5 min/次，孵二抗，摇床上常温1 h，TBST洗膜3次，5 min/次，显影。

1.2.5 免疫荧光染色鉴定hCMEC/D3细胞 在Chamber Slide的小室中接种1×105个细胞，置于培养箱中过夜。吸掉小室中的培养基，加入适量4%组织细胞固定液，于4 ℃，15 min。吸掉固定液，预冷PBS洗3次，5 min/次。预冷0.2%Triton X-100处理8～10 min。吸掉0.2%Triton X-100，预冷PBS洗3次，5 min/次。5%羊血清(用PBS稀释)，37 ℃，封闭1 h。孵相应一抗(用1%羊血清稀释)，4 ℃过夜。吸掉一抗，预冷PBS洗3次，5 min/次。避光孵相应二抗(用1%羊血清稀释)，4 ℃，1 h。吸掉二抗，预冷PBS洗3次，5 min/次(避光)。滴封片剂(封片剂：PBS=1∶1稀释)封片，指甲油固定。固定后，荧光显微镜下拍照。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测FZD1-10、LRP5/6和AXIN2的表达 用Trizol裂解细胞，RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA，Nano Drop 2000c检测RNA的浓度，逆转录得到cDNA(具体方法参照诺唯赞的说明书)，然后进行qPCR(具体方法参照诺唯赞的说明书)。

2 结 果

2.1 Wnt-S蛋白表达载体的构建 核酸电泳的结果显示Wnt-S in pcDNA3.1 (+)质粒成功构建(见图1)。

a：Lane1为Marker；Lane2，3中3 kb左右的条带为pUC57载体，1.2 kb左右的条带为Wnt-S；Lane5和6中6.4 kb左右的条带为pcDNA3.1载体，还有一个切割下的小片段小于250 bp，所以在图上没有显示。B：Lane1为Marker；Lane3、4、5中6.4 kb左右的条带为pcDNA3.1载体，1.2 kb左右的条带为Wnt-S

图1 核酸电泳结果

2.2 Wnt-S蛋白的细胞转染和表达 Western blot结果表明在转染后的细胞上清中检测到了Wnt-S蛋白，其表达纯化的最佳条件为转染后5 d收集上清，120 mmol/ml咪唑洗脱(见图2)。

a：取转染0～6 d的上清，检测Wnt-S。B：梯度浓度20～160(mmol/ml)咪唑洗脱Wnt-S。一抗Anti-His，Rabbit(1∶1000)，二抗Anti-Rabbit(1∶10000)

图2 Western blot结果

2.3 hCMEC/D3内皮细胞的鉴定 免疫荧光染色结果显示，hCMEC/D3细胞高表达内皮细胞Marker CD31、VE-cadherin和血脑屏障Marker GLUT1、MFSD2A(见图3)。

2.4 Wnt-S蛋白对hCMEC/D3细胞中Wnt/β-catenin信号通路的激活作用 首先，实时荧光定量PCR的结果显示HEK293和hCMEC/D3细胞中FZD1-10和LRP5/6的表达情况(见图4A、图4B)。其次，实时荧光定量PCR的结果显示加Wnt-S蛋白和Wnt3a蛋白处理后，HEK293和hCMEC/D3细胞中AXIN2表达显著性上调，Wnt/β-catenin信号通路被显著激活(见图4C、图4D)。

一抗CD31(1∶50)，一抗VE-cadherin(1∶100)；一抗GLUT1(1∶500)，MFSD2A(1∶500)。二抗Anti-Rabbit(1∶10000)。EC：内皮细胞；BBB：血脑屏障

图3 免疫荧光染色结果

a：HEK293细胞中Wnt受体FZD1-10和LRP5/6表达情况。B：hCMEC/D3细胞中Wnt受体FZD1-10，LRP5/6和细胞Marker(CD31和MFSD2A)表达情况。C：加药处理24 h后，HEK293细胞中AXIN2的表达情况。D：加药处理24 h后，hCMEC/D3细胞中AXIN2的表达情况。(ns：无统计学意义；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)

图4 实时荧光定量PCR的结果

3 讨 论

目前已经发现了19种不同的哺乳类Wnt蛋白，这些蛋白与10种FZD受体杂乱的结合，形成了不同的生物学功能[4，5]。Wnt翻译后通过蛋白质棕榈化作用形成了棕榈油酸酯修饰，这个修饰对于Wnt蛋白的分泌和其与FZD相互作用的关键位点形成至关重要[17～19]。然而，棕榈油酸酯化使天然Wnt蛋白变得非常疏水，这严重阻碍了Wnt重组蛋白的制备和应用，也不利于进一步了解Wnt信号通路的分子机制、FZDs亚型的功能意义、以及将Wnt蛋白作为一种新的治疗药物[16]。本文中，我们发现人工合成的Wnt替代蛋白具有与天然Wnt3a蛋白类似的生物学功能，都能激活hCMEC/D3细胞中Wnt/β-catenin信号通路。Wnt-S蛋白的优势在于能与多个FZD受体(FZD1，2，5，7，8)结合，且水溶性高、容易表达纯化和大规模制备，可能具有更广阔的生物和医学应用前景。而鉴于Wnt/β-catenin信号通路对脑血管血脑屏障功能维持起重要的调控作用，这提示我们在脑卒中发生后，Wnt-S可能作为一种新的治疗手段去保护或修复脑缺血再灌注后受损的血脑屏障，改善患者预后。