微卫星技术在紫貂个体识别中的应用

吴丹

（滇西科技师范学院 生物技术与工程学院，云南临沧 677000）

微卫星（Microsatellite）又称短串联重复序列（Short tandem repeats，STR），是20世纪80年代发展起来的一种新型分子标记技术。真核生物基因组中广泛存在着串联重复序列，Tautz（1993） 将重复单位在1～5bp，长度为几百bp的位点称为微卫星序列[1]。微卫星由核心序列和侧翼序列组成，侧翼序列比较保守，核心序列重复数的差异则形成了微卫星高度的多态性。微卫星具有突变速率快、多态性高等特性，已经被广泛应用于生物遗传作图、群体遗传研究、个体亲缘关系鉴定等研究中。

在野生动物非法盗猎和走私等案件中，涉案的动物个体数是量刑的主要依据之一。然而有时查没的野生动物及其产品难以从外形上判断出个体的数量，因此，利用微卫星技术对涉案动物及其产品进行个体识别可作为野生动物保护的重要技术手段。

紫貂（Martes zibellina）隶属于哺乳纲（Mammalia）、食肉目（Canirora）、鼬科（Mustelidae）、鼬亚科（Mustelinae）、貂属（Martes），是我国国家一级保护野生动物。紫貂因其貂皮绒毛细密丰厚，峰毛高爽灵活，墨润有光且皮板较薄而为裘皮之冠[2]，具有很高的经济价值。紫貂在我国曾分布广泛，由于滥捕滥猎以及生境破碎化，野生紫貂种群受到严重破坏，至今仅分布在我国新疆和东北地区。虽然野生动物驯养繁殖是对野外资源保护的重要手段，但紫貂由于特殊的生理特性，至今仅在俄罗斯、芬兰等少数国家获得了成功，我国自1957年开始也曾对紫貂进行过人工养殖，人工养殖下种群曾增大到1000余只，但后来种群又持续下降[3]，目前紫貂在我国驯养繁殖的关键技术尚未攻克。为保护野生紫貂种群，在加大盗猎打击力度的同时，也要建立必要的技术手段。因此，筛选出适用于紫貂种群的微卫星位点，对紫貂的种群遗传研究和野外资源保护都是十分有利的。

1 材料与方法

1.1 特异性引物的设计

因为要从一个物种中分离出新的微卫星位点是一个很大的实验室工程，而微卫星在近缘物种间的种间扩增具有很高的成功率。因此，利用已报道的近缘物种的微卫星位点，通过实验筛选出适用于紫貂的微卫星位点具有很高的可行性。

本次实验用的引物序列来自石貂（Martes foina）、美洲貂（Martse americana）、水貂（Mustela vison）已发表的文献中。实验之初共选择了33对引物，用3个紫貂DNA样本进行反复PCR实验后（反应体系见表1），最终筛选出12对能获得准确分型数据的引物[4]，引物名称及序列见表2。

表1 PCR反应体系

1.2 紫貂样本的来源

本次需进行个体识别的样本一共20个，来自2012年伊春市公安局查获的紫貂，包括15张新鲜皮张，5具已剥皮尸体。从皮张下取下的肌肉样本分别编号为1～15，从尸体头骨上取下的肌肉样本编号为A～E，采用酚氯法提取DNA。

1.3 数据分析原理和方法

利用微卫星分型来认定同一个体的原则是：所有位点上的基因型都相同，或者只有一个座位上的一个等位基因存在差别[5-6]。常用的个体识别参（Probability of Identity，P(ID)），是指无亲缘关系或者同胞个体之间具有相同基因型的概率，它表示同一种群中任意两个个体在多个微卫星位点上基因型完全一致的可能性[7]。

进行个体鉴别时，法医学中的应用标准为P(ID)值在0.001～0.0001，即认为这两个个体具有不同的基因型，来自不同的个体[8]。

本研究用Gimlet Software v1.3.3计算12对微卫星位点的联合P(ID)值，并用Excel中的MStools插件对20个样本PCR扩增后的毛细管分型结果进行个体识别。

表2 12对引物序列

2 结果与分析

2.1 微卫星位点的联合P(ID)值

计算结果显示，12对位点的联合识别力很高，即使是个体中出现双胞胎的情况，位点的错判率P(sib)只有0.00002085。因此，筛选出的12对位点是适用于紫貂的个体识别的。

Prod(biased)：矫正基因型相似概率；Prod(unbias)：无偏基因型相似概率；Prod(sibs)：双胞胎基因型相似概率。

2.2 个体识别结果

用Excel中的MStools插件对20个样本的毛细管电泳观测值进行统计分型，部分分型结果见表3。结果显示：样本A、B、C、E与6、3、13、14在12个微卫星位点的等位基因的基因型都是一致的，它们分别属于同一个体，即编号为6、3、13、14的皮张是从编号为A、B、C、E的紫貂尸体上剥下的。编号为D的样本未与任一皮张对应，属于单独的个体。所以，本次涉案的15张皮张和5具已剥皮紫貂尸体来自于16个不同的紫貂个体，也就是说本次涉案的紫貂个体数目为16只。

图1 紫貂不同个体基因型相似概率曲线

3 讨论

本次实验从石貂、美洲貂和水貂中筛选出的12个微卫星位点，能成功地应用于紫貂的微卫星扩增及后续的遗传统计分析。证明近缘物种间的微卫星种间扩增是可行的。

Zhang Y W等[9]利用人类引物成功对一对黑猩猩进行了亲缘鉴定；Xu等[10]用从家猫的微卫星引物中筛选出的7对引物对老虎进行了微卫星位点的扩增；Mukesh[11]从鸡的微卫星座位中筛选出15个位点对喜马拉雅棕尾虹雉进行了种间扩增，且这些位点也适用于另外三种鸡形目鸟类。利用已报道的微卫星位点进行近缘物种之间的跨种间扩增，在保证了实验科研价值的同时，还可以节约人力、物力和时间成本。

在现实案例中利用微卫星进行个体识别时，主要运用的识别参数是联合P(ID)值，它表示同一种群中任意两个个体在多个微卫星座位上具有一致基因型的概率，只有P(ID)值足够小（P(ID)＜0.001），才能准确地运用到个体识别中。随着微卫星位点数的增加，P(ID)值也会随着减少，但并不是位点数越多越好。一方面要考虑经济成本，另一方面，随着位点数的增多，观察到的基因分型错误率也会上升。本次实验的结果显示，按照微卫星位点的PI值由低到高增加时，当微卫星位点数目达到5对时，矫正基因型的相似概率为0.00005608＜0.001，当微卫星位点数目达到8对时，双胞胎基因型的相似概率为0.000798＜0.001，因此，微卫星位点数的选择可根据理论期望P(ID)值和同胞个体的P(ID)值来确定上下限。

另外，微卫星位点若偏离了Hardy-Weinberg平衡也会造成P(ID)值的高估，本次研究中用Genepop 4.2.1评估了12个位点在进行个体识别的紫貂群体中的哈温平衡，结果显示所有位点都没有偏离Hardy-Weinberg平衡[4]。