人肿瘤抑制因子Folliculin（FLCN）蛋白的原核表达纯化

2019-04-10申一凡黄凯悦任亚哲陈婷陆昌瑞施宇张云龙

生物化工 2019年1期

申一凡，黄凯悦，任亚哲，陈婷，陆昌瑞，施宇，张云龙

（东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620）

Birt-Hogg-Dube´（BHD）综合征是一种常染色体单基因显性遗传病，由于FLCN基因缺失或突变引起。1970年，加拿大医生Birt、Hogg和Dube发现其临床表现为细胞纤维瘤、肾囊肿、肺囊肿[1-3]。利用基因连锁分析发现BHD综合征是由FLCN基因突变和缺失引起的[4]。通过动物模型实验发现FLCN双基因敲除致死，而单基因敲除导致肾囊肿的产生[5-6]。目前的研究证实了FLCN作为肿瘤抑制因子在人体中发挥重要的作用，但FLCN诱发肿瘤的机制尚不明确。

FLCN蛋白具有高度保守性，并与目前已知的蛋白不具有同源性[7-8]。目前，FLCN的结构与功能的研究还处于起步阶段。Nookala R.K.通过X射线衍射技术解析了FLCN的C端（341～566）的结构，推测其具有鸟苷酸交换因子的功能，但尚未得到明确的功能验证实验证据[9]。FLCN的N端结构域及全长的结构和功能更是未知。目前已知FLCN通过mTOR、TGF-β、自噬等细胞增殖与发育信号通路中都发挥着重要的作用[10-11]，但具体分子机制还存在一定缺陷。为了更有效地揭示其结构与功能，FLCN的结构解析尤为重要，结构的解析将为功能的分析奠定基础。

本实验通过pGEX-6p-1载体构建GST-FLCN融合基因重组质粒，通过Top10菌种扩增基因和BL21菌种表达蛋白。通过GST亲和介质、离子交换介质纯化获取GST-FLCN融合蛋白，再用Xa因子蛋白酶切除GST标签，经二次分子筛纯化获取高纯度FLCN蛋白，从而为FLCN的结构和功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

pGEX-6p-1载体、重组质粒pET28a-FLCN，由实验室提供；E.coli Top10、E.coli BL21，质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒购自上海生工；限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶，购自NEB公司；GST亲和介质，购自常州天地人和公司；高压细胞破碎仪JNBIOJN-3000，购自广州聚能纳米生物科技股份有限公司；其余试剂皆为分析纯。

1.2 方法与步骤

1.2.1 重组质粒构建

优化并构建pGEX-6p-1-GST-FLCN重组质粒，首先利用PCR扩增FLCN基因，模板为本实验室重组质粒pET28a-FLCN，上、下游引物委托上海生工公司合成，上游引物：5'-ATACATGGATCCAATGCCA TTGTTGCCCTGTGTC-3'；下游引物：5'-ATACATC TCGAGTTAATTACGAGATTCAGATGCG-3'。随后，将PCR产物和pGEX-6p-1载体利用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，使用生工的胶回收试剂盒回收FLCN基因和载体，再在16 ℃下T4 DNA连接酶过夜连接。将连接产物转入Top10感受态细胞后，委托上海生工进行测序鉴定。

1.2.2 表达纯化GST-FLCN融合蛋白

将重组质粒转入BL21感受态细胞中，于平板上37 ℃过夜培养。挑取单克隆，加入LB培养基中37 ℃225 r/min培养至OD600=0.5左右，加入1 mmol/L的IPTG在16 ℃诱导表达。

将菌液4 000 r/min 4 ℃离心30 min，弃上清后在冰上加入预冷凋亡1 L菌液/20 mL bind buffer（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH=8.0）重悬沉淀。再加入终浓度1 mmol/L的PMSF蛋白酶抑制剂，使用细胞高压破碎仪在4 ℃，1.3×105kPa的压力下破碎细胞。将破碎后的菌液两次12 000 r/min 4 ℃离心30 min。使用Wash Buffer（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L谷胱甘肽，pH=8.0）洗杂蛋白，使用Elusion Buffer（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L谷胱甘肽，pH=8.0）洗脱蛋白。将洗脱液浓缩收集。

1.2.3 Xa因子蛋白酶酶切

将纯化好的GST-FLCN融合蛋白和1 μL的Xa因子蛋白酶加入Buffer（50 mmol/L Tris，1 mmol/L DTT，pH=8.0）中，4 ℃酶切过夜。将酶切后的蛋白通过GST介质亲和纯化，收集穿出液。

1.2.4 FLCN蛋白的分子筛纯化

将酶切后的FLCN融合蛋白通过分子筛进一步纯化，以获得更高纯度的FLCN蛋白。FLCN蛋白的分子量为64 kDa，使用Superdex 75层析柱，在SCGp100蛋白层析系统下进行纯化。使用Buffer（50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl）进行上样、洗脱及纯化。

2 结果与分析

2.1 生物信息学分析FLCN蛋白组成

在Uniprot官网上下载FLCN的蛋白序列，使用EditSeq软件对蛋白序列进行分析，结果见图1。如图1a，发现FLCN蛋白中大部分蛋白为疏水性氨基酸，表明其水溶性不高，为此选用了GST标签增加其溶解性。在http://cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc网站上对FLCN进行糖基化位点预测，发现其在494位点可能存在糖基化修饰。糖基化修饰有利于蛋白和细胞膜的接触或结合，因而推测FLCN可能参与跨膜转运。

图1 FLCN蛋白生物信息学分析

2.2 FLCN重组质粒的构建

以pET28a-FLCN为模板，使用PCR扩增目的基因。使用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切将目的基因和载体，并用T4 DNA连接酶将FLCN连入pGEX-6p-1载体中。将构建好FLCN重组质粒与pGEX-6p-1电泳，检测结果如图2所示。在生工测序结果显示构建成功并且没有基因突变。

图2 FLCN重组质粒的构建结果

2.3 GST-FLCN融合蛋白表达纯化

将构建的GST-FLCN质粒转入大肠杆菌中诱导表达，将菌液高压破碎获得含有目的蛋白的溶液，随后通过GST介质纯化GST-FLCN融合蛋白。使用Wash Buffer多次洗脱能将大部分杂蛋白洗去，但是还会有一些杂蛋白和目的蛋白混在一起，无法洗脱，如图3所示。

图3 GST-FLCN蛋白的表达纯化检测结果

2.4 GST-FLCN融合蛋白Xa因子蛋白酶酶切

在蛋白浓缩样品中加入适量Xa因子蛋白酶，4 ℃静止过夜酶切。将酶切样品再通过GST介质亲和纯化，得到FLCN蛋白。如图4所示，Xa因子蛋白酶酶切后得到了FLCN蛋白。

2.5 分子筛纯化FLCN蛋白

GST-FLCN经过酶切后，得到的FLCN蛋白中还有一部分杂蛋白，为了获得更高纯度的FLCN蛋白，使用了分子筛进行进一步的纯化。FLCN蛋白酶切后的分子量为64 kDa，所以选用Superdex 75层析柱，在SCGp100蛋白层析系统下进行纯化。如图5所示，通过SDS检测，可以发现得到了纯度较高的FLCN蛋白，其纯度为90%左右。