复合果蔬汁促进植物乳杆菌在牛奶中增殖研究

文/何建新 江远智 王顺余 李 渊 陆圆圆 张 灏 杭 锋＊

（1 浙江李子园食品股份有限公司；2 江南大学食品学院）

益生菌作为活的生物体[1，2]被应用于各种食品中，可以提高食品本身的价值和抗腐败能力，改善人体肠道微生物菌群，调节免疫原性反应[3]，如谷物豆类发酵食品[4]、功能性寡糖[5]和发酵酸奶。牛奶是重要的益生菌载体[6]，因为牛奶含有丰富的蛋白质、维生素、碳水化合物，可以为微生物提供丰富的碳源、氮源和一些微量元素，满足大多数微生物的生长，还可以使微生物长时间存活，基本满足世界上绝大部分人对益生菌的需求[7]。

随着经济的发展，食品的发展不仅要求营养，而且还需要具备一定的功能[8]，因此，更多的益生菌被应用到食品研发中。植物乳杆菌是人体肠道的常见微生物，除了少数几株菌对酸和胆盐比较敏感外，植物乳杆菌皆具有较强的耐酸和耐胆盐能力[9，10]，可以与致病菌（如大肠杆菌）竞争[11]，降低致病菌在人体肠道的生长和繁殖能力，降低胆固醇水平[12]，具有吸附重金属的作用[13]，同时，植物乳杆菌可以粘附在肠道黏膜表面[14]，作为活的生物体起作用。因此，以牛奶为载体，让植物乳杆菌在其中生长，既可以作为牛奶的发酵剂，也能将植物乳杆菌的功能植入到牛奶中，还可以保持单位体积的高活菌数，而且容易被人们所接受。

植物乳杆菌属于营养缺陷型细菌，自身不能合成多种氨基酸和嘌呤[15]，同时，植物乳杆菌缺乏胞外蛋白酶基因[16]，不能合成蛋白质水解酶[17]，不能有效将牛奶中的乳蛋白分解成多肽和氨基酸而用于植物乳杆菌的生长和繁殖。因此，仅靠牛奶中的营养成分不能满足植物乳杆菌的代谢和繁殖，导致牛奶难以凝乳和单位毫升内活菌数难以提高，需要寻找可以促进植物乳杆菌在牛奶中生长的增殖剂，使得植物乳杆菌可以在牛奶中快速增殖。果蔬汁中含丰富的氨基酸、维生素和生物活性物质，不仅能够促进植物乳杆菌的生长[18]，还可以作为植物乳杆菌的载体[19]，同时，植物乳杆菌CCFM 8661是从泡菜中分离得到的，因此，果蔬汁中含有植物乳杆菌生长和繁殖所需的营养物质。

1 材料与方法

1.1 菌种

植物乳杆菌CCFM 8661，江南大学于2007年从中国传统发酵泡菜中分离获得，菌种保藏编号为CGMCC NO.5494，菌粉由江苏省微康生物科技有限公司生产（活菌数为3.8×1011CFU/g）；YO-MIX M11商业酸奶发酵剂（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌），杜邦丹尼斯克公司生产。

1.2 材料与试剂

材料：菠萝、黄瓜、猕猴桃、豆浆、玉米、番茄、胡萝卜（扬州广陵区大润发超市）；天然乳清（上海仟爵生物科技有限公司）；低脂果胶（上海蓝安实业有限公司）；玉米淀粉NOVATION 2300（宜安瑞中国有限公司）；蔗糖［一级，上海糖业烟酒（集团）有限公司］；香蕉浆（DOHLER）；全脂奶粉（徐州凯舜乳业有限公司）。

试剂：酚酞（98%，博飞美科）；琼脂粉、鱼粉蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏，均为生化试剂，氢氧化钠、无水磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、无水乙酸钠、葡萄糖、无水乙醇、氯化钠、七水硫酸镁、一水硫酸锰、L（+）-抗坏血酸，均为分析纯，吐温80，化学纯（国药集团化学试剂有限公司）；甘油磷酸钠、胰蛋白胨（生工生物工程股份有限公司）；大豆蛋白胨（博试生有限公司）。

1.3 仪器与设备

碱式滴定管；培养箱BSP-150（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；超纯水机VE-60CH-AI（深圳市宏森环保科技有限公司）；立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-70A（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；超净台（苏州安泰空气技术有限公司）；实验室pH计ST3100［奥豪斯仪器（常州）有限公司］；榨汁机HS-200（中山市海尚电器有限公司）。

1.4 酸奶制作流程

1.4.1 原料前处理

将菠萝、黄瓜、猕猴桃、玉米、番茄、胡萝卜用清水洗净，榨汁机打浆，4 层纱布过滤，收集滤液即为果蔬汁增殖剂。菠萝汁、黄瓜汁、猕猴桃汁均在95 ℃条件下灭酶15 min，-40 ℃贮存备用。复合果蔬汁的组合原则是较高pH值和较低pH值的果蔬汁进行混合，牛奶初始pH值低会影响其稳定性。复合果蔬汁分别为黄瓜汁-猕猴桃汁（1∶1）、菠萝汁-香蕉浆（1∶1）、豆浆汁-玉米汁（1∶1）、番茄汁-胡萝卜汁（1∶1），pH值分别为4.24、4.25、5.60、4.70，添加量为7.5%，添加复合果蔬汁后的牛奶pH值分别为6.52、6.36、6.57、6.54。

1.4.2 发酵乳工艺

将90 g奶粉与500 g水混合，搅拌均匀，置于4 ℃冰箱中；将70 g糖溶解在260 g水中，常温下加入1.5 g低脂果胶和2 g天然乳清，搅拌均匀，然后将两者加热至55 ℃后互混，继续搅拌均匀，加入自来水使总质量为1 000 g，即为发酵乳基料。向发酵乳基料中缓慢添加4 种复合果蔬汁，添加量为7.5%；同时，为了进一步考察香蕉浆和菠萝汁对植物乳杆菌CCFM 8661的增殖作用，分别单独添加香蕉浆和菠萝汁，添加量分别为5%、7.5%、10%，上述即为含果蔬汁的发酵乳基料。

将60 g发酵乳基料和含果蔬汁的发酵乳基料置于100 mL奶瓶中，放入灭菌锅内，108 ℃条件下灭菌15 min，灭菌结束后冷却至室温，接种发酵剂，其中植物乳杆菌CCFM8661的接种量为2.5×107CFU/mL，商业酸奶发酵剂（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）的接种量为6.0×106CFU/mL。添加果蔬汁的发酵乳基料接种植物乳杆菌CCFM8661，发酵乳基料接种植物乳杆菌CCFM8661作为空白对照，接种商业酸奶发酵剂（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）和植物乳杆菌CCFM8661进行协同发酵试验。

1.5 检测方法

协同发酵试验在发酵0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h时取样，其余试验在发酵0 h、24 h、48 h时取样。

发酵乳样品的pH值使用pH计直接测定；滴定酸度参照《食品安全国家标准 食品酸度的测定》（GB 5009.239-2016）；活菌数采用稀释梯度平板计数法，超净台上用无菌移液枪取5 mL样品于灭菌的牛奶瓶中，加入45 mL生理盐水，依次稀释10 倍，一直稀释到10-7梯度，取稀释梯度10-5、10-6、10-7各1 mL于培养皿中，其中以植物乳杆菌CCFM8661作为发酵剂的样品使用MRS培养基计数，以商业酸奶发酵剂（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）和植物乳杆菌CCFM8661共同作为发酵剂的样品分别使用M17培养基和MRS培养基计数。

图1 温度对植物乳杆菌CCFM8661增殖的影响

图2 空白对照组和添加4 种复合果蔬汁样品组发酵过程的pH值变化

2 结果分析

2.1 温度对植物乳杆菌CCFM8661增殖的影响

为研究不同温度条件下植物乳杆菌CCFM8661的增殖情况，在32℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃条件下发酵24 h，测定空白对照组和添加4 种复合果蔬汁样品组的活菌数，结果见图1。在不添加4 种复合果蔬汁情况下，发酵24 h时，活菌数未发生明显增加，总体差异不大。在添加4 种复合果蔬汁情况下，菠萝汁-香蕉浆样品组促进增殖作用最好，32 ℃、35 ℃、37 ℃、40℃条件下发酵24 h后的活菌数分别为4.7×108CFU/mL、1.4×109CFU/mL、1.21×109CFU/mL、5.7×108CFU/mL，说明植物乳杆菌CCFM8661在32 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃均可生长，35 ℃、37℃比32 ℃、40 ℃更利于植物乳杆菌CCFM8661的生长，35 ℃为最适生长温度。

2.2 滴定酸度和pH值

由图3可知，滴定酸度与活菌数变化基本一致，菠萝汁-香蕉浆样品组在发酵24 h时的滴定酸度和活菌数最高，分别为100°T和1.4×109CFU/mL；发酵24 h后，植物乳杆菌CCFM8661的生长进入稳定期，后续发酵对活菌数影响不大，滴定酸度的增加也不显著，发酵48 h时滴定酸度为111°T，仅上升了11°T。

酸是植物乳杆菌的代谢产物，发酵乳的滴定酸度和pH值可以作为活菌数的表征，也可以作为发酵乳的理化参数，空白对照组和添加4种复合果蔬汁样品组发酵过程的pH值变化如图2所示，滴定酸度和活菌数变化见图3。

由图2可知，发酵时间越长，pH值越低；发酵24 h时，样品组的pH值比空白对照组低，pH最低的是菠萝汁-香蕉浆样品组，为3.8，pH最高的是番茄汁-胡萝卜汁样品组，为5.35；发酵24 h后，菠萝汁-香蕉浆样品组继续发酵的pH值下降不明显，至48 h时pH值仅下降0.03。

2.3 复合果蔬汁对植物乳杆菌CCFM8661增殖的影响

发酵温度为35 ℃，空白对照组和添加4 种复合果蔬汁样品组在0 h、24 h、48 h时的活菌数见图4。植物乳杆菌CCFM8661接种量为2.5×107CFU/mL，发酵24 h后，空白对照组的活菌数依然无法达到1.0×108CFU/mL；样品组发酵24 h后的活菌数全部可以达到1.0×108CFU/mL，促进生长作用最好的是菠萝汁-香蕉浆样品组，活菌数最高可以达到1.4×109CFU/mL，促进生长作用最差的是番茄汁-胡萝卜汁样品组，活菌数仅能达到1.49×108CFU/mL；发酵24 h后，后续发酵并没有使活菌数上升，说明24 h后的发酵液不适合植物乳杆菌CCFM8661继续增殖，可以将24 h作为发酵终点。

图3 空白对照组和添加4 种复合果蔬汁样品组发酵过程的滴定酸度和活菌数变化

图4 复合果蔬汁对植物乳杆菌CCFM8661增殖的影响

2.4 菠萝汁和香蕉浆对植物乳杆菌CCFM8661增殖的影响

菠萝汁、香蕉浆、菠萝汁-香蕉浆（1∶1）样品组在35 ℃条件下发酵0 h、24 h、48 h后的酸度和活菌数见图5。单独添加香蕉浆对促进植物乳杆菌CCFM8661增殖的效果不好，最高活菌数仅能到达1.39×108CFU/mL，最高滴定酸度为55 °T，发酵乳未发生凝乳；单独添加菠萝汁对促进植物乳杆菌CCFM8661增殖的效果很好，添加量越大，活菌数和滴定酸度越高，在发酵24 h时，菠萝汁添加量为5%、7.5%、10%样品组的活菌数分别为1.54×109CFU/mL、1.69×109CFU/mL、1.85×109CFU/mL，滴定酸度分别为110°T、112°T、127°T。将5%菠萝汁添加到牛奶中，108 ℃灭菌15 min后，出现水相层，且添加量越高，水相层越厚。分别添加5%香蕉浆和5%菠萝汁的发酵乳基料的初始pH值为6.54和6.28，说明初始pH值低会影响体系稳定性，加入香蕉浆可以改善体系的初始pH值，添加量为7.5%的菠萝汁-香蕉浆体系稳定性相对较好。

2.5 协同发酵试验

植物乳杆菌缺乏蛋白质水解酶，不能水解牛奶中的乳蛋白，因此牛奶不能满足植物乳杆菌对生长和繁殖的营养需求。商业酸奶发酵剂（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）可以水解牛奶中的乳蛋白[20]，本文将植物乳杆菌CCFM8661和商业酸奶发酵剂（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）同时接种到牛奶中，探究植物乳杆菌CCFM8661能否利用商业酸奶发酵剂的代谢产物增殖。空白对照组和协同发酵样品组在35 ℃条件下发酵0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h后的滴定酸度与活菌数见图6，协同发酵样品组和菠萝汁-香蕉浆样品组在35 ℃条件下发酵0 h、24 h、48 h后的活菌数见图7。

由图6可知，协同发酵使植物乳杆菌CCFM8661在发酵液中的活菌数明显升高，发酵24 h时的活菌数可达到3.3×108CFU/mL，比植物乳杆菌CCFM8661单独发酵效果好；前6 h的发酵过程中，植物乳杆菌CCFM8661生长缓慢，活菌数只有9.5×107CFU/mL，但总活菌数达到5.4×108CFU/mL，商业酸奶发酵剂（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）生长迅速；6 h后的发酵过程中，总活菌数的增加以植物乳杆菌CCFM8661为主，发酵48 h时，植物乳杆菌CCFM8661活菌数达到4.2×108CFU/mL，说明商业酸奶发酵剂（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）的代谢产物可以被植物乳杆菌CCFM8661利用，可能是商业酸奶发酵剂（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）将乳蛋白分解成多肽和氨基酸，进而被植物乳杆菌CCFM8661利用。

图5 菠萝汁和香蕉浆对植物乳杆菌CCFM8661增殖的影响

由图7可知，协同发酵可以使植物乳杆菌CCFM8661在牛奶中增殖，但促进作用不如添加复合菠萝汁-香蕉浆好。添加复合菠萝汁-香蕉浆可以使牛奶中的植物乳杆菌CCFM8661活菌数上升2 个数量级，而协同发酵只能使牛奶中植物乳杆菌CCFM8661活菌数升高1 个数量级，但协同发酵总活菌数可以达到9.8×108CFU/mL，也可以作为新型酸奶的发酵剂。

3 讨论与分析

植物乳杆菌属于乳酸菌属，产酸能力比较强，而且具有较强耐酸、耐胆盐能力[9，10]，黏附在肠道黏膜表面的能力较强[14]，人体肠道植物乳杆菌增多，则肠道表面黏附致病菌减少，不能黏附在肠道表面的致病菌会随着粪便排出，降低了致病菌在肠道中长时间停留的危害，因此，植物乳杆菌具有益生特性。

图6 空白对照组和协同发酵样品组发酵过程的滴定酸度和活菌数

细菌在生长繁殖过程中不可避免地涉及到多种酶，酶在转运和代谢过程中起着关键作用，如果酶的活性受到影响，将严重影响细菌的生长和代谢。温度与酶的活性息息相关，在最适温度条件下，酶的活性最高，合成细菌生长和繁殖的必需氨基酸、核苷酸、蛋白质的速度也最快，因此，活菌数最高。本文研究结果表明，35 ℃最适合植物乳杆菌CCFM8661的生长。

图7 协同发酵样品组和菠萝汁-香蕉浆样品组发酵过程的活菌数

国内外研究者通过添加氨基酸、核苷酸、矿物质、维生素和果蔬汁等增殖剂，促进植物乳杆菌在牛奶中增殖。Ma等[15]通过试验证明了异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和核苷酸前体物质是植物乳杆菌在牛奶中增殖的必需成分。类芽孢杆菌BD3526发酵上清液[21]、酵母提取物、酪蛋白酶解物、蛋白胨[17]作为增殖剂，可以促进植物乳杆菌生长，而且可以使酸奶凝乳，说明植物乳杆菌利用乳蛋白能力较弱，通过添加被植物乳杆菌吸收利用的氮源，可以促进植物乳杆菌在牛奶中增殖。Yang等[18]研究表明，添加10%黑莓汁可以使植物乳杆菌在牛奶中的活菌数达到1×1010CFU/mL。本文试验结果表明，果蔬汁含有可以被植物乳杆菌利用的氮源，能够促进植物乳杆菌在牛奶中增殖，菠萝汁-香蕉浆（1∶1）效果最好。

一种菌的代谢产物可以作为另一种菌的原料，同时，多种菌同时作为发酵剂，可以产生更多的生物活性物质[22，23]，加强机体的免疫能力。通过协同发酵使植物乳杆菌在牛奶中生长也是一种比较廉价的方式，具有较大的商业价值[24]。本文试验结果表明，协同发酵使植物乳杆菌CCFM8661活菌数升高了50倍，总活菌数比普通酸奶的活菌数要高，作为复合型酸奶的新品，也可以投入市场。

4 结论

通过空白对照组与添加果蔬汁样品组的对比试验，添加果蔬汁可以明显改善植物乳杆菌CCFM8661在牛奶中的增殖，菠萝汁-香蕉浆（1∶1）效果最好，活菌数可达1.4×109CFU/mL，而且酸奶稳定性及风味比较好；菠萝汁添加量高，则活菌数高，但体系稳定性不好；协同发酵可以使植物乳杆菌CCFM8661活菌数达到4.2×108CFU/mL，但总活菌数不高。因此，以菠萝汁-香蕉浆（1∶1）作为植物乳杆菌CCFM8661在牛奶中的增殖剂，35 ℃条件下发酵24 h效果最佳。