木姜叶柯茶样品中总酚含量测定研究

敖绍林，宋成建，周贤平，裴正飞，高 阳，周福才，张亚州*

(1.贵州理工学院，贵州 贵阳 550031；2.广西苷亮健生物技术有限公司，广西 南宁 530001)

0 引言

木姜叶柯为壳斗科柯属植物Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun.属常绿乔木，别名甜茶(通称)、甜叶子树(云南)、胖稠(广东)、甜味菜、大叶稠子、甘茶(贵州)、多穗石柯等，其以野生状态分布于我国长江以南各省区海拔500～2 500 m的低山密林中，印度、泰国也有分布[1]。现代研究表明，木姜叶柯中的黄酮类成分主要是根皮苷与三叶苷，属于二氢查尔酮类，它们具有降血糖，降血压，降脂及抗过敏，抗炎等作用，尤其根皮苷在糖尿病及其并发症的防治中具有独特的效果[2-5]。但是木姜叶柯中另外一类主要化学成分为多酚类，具有抗氧化和清除自由基功能活性物质，还有抗肿瘤、抑菌、抗病毒、抗心脑血管疾病等活性，已被广泛应用于医疗和保健行业，具有极大的利用前景[6]。

木姜叶柯甜茶在2017年6月获得了国家卫计委新食品原料批复，在民间多使用其娕叶经加工而成的代茶饮。本研究拟通过对收集的主要产区的木姜叶柯的各种茶叶及原植物共12份样品，采用Folin-Ciocalteu比色法测定样品中的总酚含量，以明确不同产地、不同来源的木姜叶柯茶叶及原植物中多酚情况的了解。

1 试剂、试药与仪器

木姜叶柯样品为广西苷亮健生物技术公司供应或通过购买获得(详细情况见下表1中内容)，所有样品均由贵阳中医学院董立莎教授鉴定为木姜叶柯植物来源；没食子酸对照品(购于中国药品生物制品检定所)，无水碳酸钠(分析纯，秦皇岛市化学试剂厂)，钨酸钠(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)，钼酸钠(分析纯，天津市化学试剂四厂)，硫酸锂(分析纯，重庆东方试剂厂)；乙腈(HPLC级，成都科龙试剂有限公司)；甲醇(HPLC级，成都科龙试剂有限公司)；磷酸(分析纯，北京化工厂)；水为娃哈哈纯净水。TU-1901紫外可见分光光度仪(北京普析通用仪器有限公司)；BSA124S分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；KQ-300DB型数控超声波清洗仪(昆山 市超声仪器有限公司)。

表1 收集的木姜叶柯原植物部位及茶的样品

2 方法与结果[7-8]

2.1 磷钼钨酸试液的配制

取钨酸钠100 g，钼酸钠25 g，加水700 mL使溶解，加盐酸 100 mL、磷酸 50 mL，加热回流10 hr，放冷后现加硫酸锂 150 g，水50 mL和溴0.2 mL，煮沸除去残留的溴(约15 min)，冷却，加水稀释至1 000 mL，滤过，即得。

2.2 对照溶液的配制

精密称取没食子酸对照品25.2 mg，置25 mL的棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5 mL，置100 mL的棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得(每mL中含没食子酸0.0504 mg)

2.3 供试品溶液的配制

精密称取样品约100 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水适量，放置 30 min，振摇，超声处理30 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 总酚测定

精密量取供试品溶液1 mL，置25 mL棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液 1 mL，再分别加水11 mL，用29%的碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟(以相应的试剂为空白)，照紫外—可见分光光度法在760 nm的波长处测定吸光度。

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液 0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分别置 25 mL 的棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1 mL，再分别加水 11.5 mL、11 mL、10 mL、9.0 mL、8 mL、7 mL，用29%的碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟(以相应的试剂为空白)，照紫外—可见分光光度法在760 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

标准曲线的绘制：分别以在760 nm的波长下测定的吸收值A，以溶液浓度C(μg)对吸收值A进行线形回归，得线形回归方程：C=270.877 A-8.307；r=0.9995；线形范围：25.2～201.6 μg 时线性关系良好。见下表2：

表2 没食子酸线性关系考察(n=3)

2.5.2 精密度试验

取溶液，精密吸取上配同一对照品溶液(浓度50.4 μg·mL-1)2 mL，置 25 mL 棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1 mL”起，加水9 mL，重复6次测定吸光度(以相应的试剂操作为空白)，即得。结果吸光度值RSD为0.15%，精密度良好。见下表3：

表3 精密度试验数据(n=6)

2.6 重复性研究

精密称取样品11粉末约100 mg，平行3份，加水适量，放置30 min，振摇，超声处理30分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。依法测定吸光度A，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，即得。结果总多酚含量测定方法重复性试验表明RSD为0.56%，(n=3)，样品重复性良好。见下表4：

表4 总多酚含量测定的重复性试验(n=3)

2.7 稳定性研究

精密吸取同一重复性试验的供试品(样品11)溶液，分别在不同时间(0，1，2，4 hr)测定，结果表明，样品总生物碱测定在2小时基本保持稳定，所以样品配制后最好在2 hr内测定结果较好。见下表5：

表5 总多酚含量测定的稳定性试验(n=3)

2.8 加样回收率试验

分别精密称取上面重复性试验样品11(样品中总多酚含量9.095%)9份各50 mg，精密加入其样品总多酚含量的75%、100%、125%的没食子酸对照品溶液(精密称取没食子酸对照50.2 mg至50 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀即得。浓度 1.004 mg·mL-1)加水适量，放置30 min，振摇，超声处理30 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。测定吸光度A，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，即得。结果表明，本总多酚含量测定方法的加样平均回收率102.23%，RSD为0.77%，回收率良好。

表6 总多酚加样回收率考察试验数据(n=9)

2.9 样品中多酚含量测定结果

方法同上，样品测定中处理方法，测定吸光度A，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，即得。结果见表11。

表7 药材样品中总多酚含量测定结果(n=2)

结果如表7所示，通过本试验方法测定发现收集的嫩叶中总酚含量最高，多酚含量为11.414%；其次为其它以嫩叶为原料加工的代茶制品，含量最低的为枝条，多酚含量为1.806%。

3 结语

目前对木姜叶柯叶中主要成份的研究主要集中根皮苷、三叶苷和根皮素等二氢查尔酮类成分，由于它们的含量较高，一般认为它们为主要功效物质。多酚类成分在木姜叶柯植物及茶叶加工品中往往被忽略，另外由于多酚类成分化学成分较复杂，也导致了对它们的相关研究较少。

本研究中选用的Folin-Ciocalteu比色法进行总酚测定时，放置时间不能太长，进行显色后应尽量在2小时内进行样品的测定；对样品的处理溶剂中发现，甲醇、乙醇容易使总酚成分含量偏低而影响含量的测定结果，所以最后确定提取溶剂选用水较合适。

本次研究就主要针对对收集于不同产地，不同部位的原植物及加工制品进行其总酚含量测定。总酚测定本实验采用了传统的Folin-Ciocalteu比色法，最后确定收集到的12份木姜叶柯样品中总酚的含量差异较大，范围从1.806%到11.414%之间，而其中木姜叶柯枝干样品中总酚远远的低于广西南阳乡木姜叶柯嫩叶样品中含量，老叶中的总酚含量也低于一般其它的以嫩叶为原料的制成品。