丁香酚对长薄鳅幼鱼麻醉效果的研究

张建明，田 甜，姜 伟

(1.中国长江三峡集团有限公司中华鲟研究所, 湖北 宜昌 443100;2.三峡工程鱼类资源保护湖北省重点实验室, 湖北 宜昌 443100)

【研究意义】长薄鳅(Leptobotiaelongate，Bleeker)，又称薄鳅、花鳅，属鳅科(Cobitidae)、沙鳅亚科(Botiinae)、薄鳅属(Leptobotia)，系长江珍稀特有鱼类，自1998年起正式列入中国濒危动物红皮书[1]。近年来，受过度捕捞、环境污染等人为因素的影响，长薄鳅的栖息环境受到严重影响，导致其数量越来越少，种群结构日益发生变化，亲鱼数量不足，个体呈现小龄化趋势，长薄鳅已达三级急切保护程度[2]。国内进行了有关长薄鳅生物学特征、苗种培育、生长发育、血液学、急性毒性试验等[3-7]方面的研究。【前人研究进展】鱼体麻醉能有效抑制鱼类在操作中的应激反应，对鱼类起到保护作用。不同类型的操作需要不同浓度的麻醉剂进行麻醉，以期达到适宜于操作的目的，同时最大程度降低对鱼体的伤害，如长途运输、鱼体标记、生物学性状观察测量等操作需要区别对待，针对不同类型的操作，进行不同程度的麻醉。丁香酚(Eugenol)又称丁香油、丁香油酚，是一种油状的有类似于丁香香味的天然化合物，广泛存在于丁香油、肉桂叶油、樟脑油等芳香油中，对鱼类有强烈的麻醉作用。丁香酚已被智利、新西兰、澳大利亚等多国认定为没有残留期的合法水产麻醉剂，被广泛用于鱼类的麻醉[8]。【本研究切入点】在鱼类麻醉研究方面已经对中华鲟(Acipensersinensis)、斑马鱼(Daniorerio)、鲤鱼(Cyprinuscarpio)、罗非鱼(Oreochromisspp.)、斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)等多种鱼类开展了相关麻醉研究工作[9-12]，但丁香酚对长薄鳅的麻醉研究尚未见相关报道。【拟解决的关键问题】为此，本试验开展了丁香酚对长薄鳅幼鱼麻醉效果的研究，旨在为丁香酚在长薄鳅幼鱼的长途运输、标记放流等人为操作方面提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验鱼为中国长江三峡集团公司中华鲟研究所云南乌东德水电站鱼类增殖放流站人工培育的长薄鳅幼鱼。挑选体格健康、行动敏捷、无病无伤、规格基本一致的幼鱼用于试验，试验鱼规格为平均体长(5.57±0.29)cm，平均体质量(1.95±0.24)g，试验前在圆形暂养池(直径3 m，水深0.7 m)中暂养5 d，试验开始前2 d及试验期间不投喂。

试验用丁香酚由上海麦克林生化科技有限公司提供，含量99 %。使用前按丁香酚与无水乙醇1∶9比例配制溶液。

1.2 试验条件

试验在塑料盆内进行，试验用水为经过曝气和静止沉淀后的金沙江水，水温(22±1)℃，溶氧保持在6.0 mg/L以上。试验期间保持试验场所安静、减少外界干扰对鱼类造成的影响。

1.3 试验方法

1.3.1 长薄鳅幼鱼麻醉阶段和复苏过程的分期观察 选取5尾长薄鳅幼鱼置于60 mg/L的丁香酚麻醉液中进行预实验，观察鱼体麻醉阶段和复苏过程中的行为变化，记录各个麻醉阶段和复苏过程中的行为变化特征。根据长薄鳅幼鱼的试验观察结果，并参考郭丰红及刘长琳等[13-14]的分级标准，将长薄鳅幼鱼麻醉程度划分为Ⅰ～Ⅶ期(各阶段分期名称及行为特征详见表1)，复苏过程划分为Ⅰ～Ⅳ期，各阶段分期名称及行为特征详见表2。

1.3.2 不同浓度丁香酚麻醉剂对长薄鳅幼鱼的麻醉效果 根据预试验结果，设计6个丁香酚浓度梯度，分别为20、40、60、80、100、120 mg/L，每个浓度梯度3个重复。每组试验选取10尾长薄鳅幼鱼，试验过程中记录长薄鳅幼鱼的麻醉时间、复苏时间、复苏率、72 h存活率等指标。麻醉所需时间是指鱼被放进麻醉剂溶液开始到鱼体侧翻的时间，复苏所需时间是指麻醉鱼放入清水中开始至鱼的行为完全恢复正常状态所需的时间。

表1 长薄鳅幼鱼麻醉程度分期及行为特征

表2 长薄鳅幼鱼复苏过程分期及行为特征

1.3.3 不同浓度丁香酚麻醉剂对长薄鳅幼鱼呼吸频率的影响 试验设置20、40、60、80、100、120 mg/L等6个浓度处理组，每组10尾长薄鳅幼鱼。呼吸频率是指1 min内鱼体的呼吸次数，1次呼吸是以鱼体鳃盖一张一合为准，统计连续呼吸30 s时各处理组长薄鳅幼鱼的呼吸次数，然后换算为1 min内呼吸次数即为鱼体对应的呼吸频率。每个处理组长薄鳅幼鱼的呼吸频率取10尾长薄鳅幼鱼的平均值。

1.3.4 在空气中暴露时间长短对深度麻醉长薄鳅幼鱼复苏的影响 为研究麻醉后离水操作的可行性，选用60 mg/L的丁香酚浓度对长薄鳅幼鱼进行麻醉，待鱼体麻醉后，将试验鱼置于空气中进行暴露，暴露时间分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 min，之后转入清水进行复苏，记录复苏所需时间、复苏率及72 h存活率，每组10尾试验鱼。

1.3.5 模拟长途运输试验 选取4种模式对长薄鳅幼鱼进行模拟长途运输试验。模式1：长薄鳅幼鱼直接放入10 mg/L丁香酚麻醉液中连续浸泡10 h；模式2：长薄鳅幼鱼直接放入20 mg/L丁香酚麻醉液中连续浸泡10 h；模式3：长薄鳅幼鱼经60 mg/L的丁香酚麻醉后，立即转入10 mg/L丁香酚麻醉液中连续浸泡10 h；模式4：长薄鳅幼鱼经60 mg/L的丁香酚麻醉后，立即转入20 mg/L丁香酚麻醉液中连续浸泡10 h。试验期间各组微充气保证溶氧，浸泡10 h后放入清水进行复苏，观察统计各组的镇静效果、复苏率及成活率，每组10尾试验鱼。

1.4 数据处理与分析

试验数据通过Excel软件进行统计，试验结果以平均值±标准偏差的形式表示，采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 结果与分析

2.1 不同浓度丁香酚麻醉剂对长薄鳅幼鱼的麻醉效果

从表3中可知，20～120 mg/L质量浓度的丁香酚均能使长薄鳅幼鱼进入第Ⅴ期(麻醉期)，并且麻醉后及时进行复苏的复苏率均为100 %，复苏后72 h内的存活率也均为100 %；同时，从试验结果的多重比较得知，20、40 mg/L试验组的入麻时间与其它各组存在显著差异(P<0.05)；60与80 mg/L试验组差异不显著(P>0.05)，与其它各组差异显著(P<0.05)；80 mg/L试验组与60、100 mg/L试验组差异不显著(P>0.05)，与其余各组差异显著(P<0.05)；100 mg/L试验组与80、120 mg/L试验组差异不显著(P>0.05)，与其余各组差异显著(P<0.05)；120 mg/L试验组与100 mg/L试验组差异不显著(P>0.05)，与其余各组差异显著(P<0.05)。不同组别之间复苏所用时间均存在显著差异(P<0.05)。

丁香酚浓度在20～120 mg/L范围内，平均入麻时间随着丁香酚麻醉剂浓度的增加而减少，两者呈负相关(图1)，通过回归计算得知，丁香酚浓度与平均入麻时间的相关关系为：y=232x-1.328，R2=0.9831；式中y为入麻所需时间(s)，x为丁香酚浓度(mg/L)。平均复苏时间随着丁香酚浓度的增加而增加，复苏时间与丁香酚浓度呈正相关(图1)，通过回归计算得知，丁香酚浓度与平均复苏时间的相关关系为：y=61.297x+95.027，R2=0.9802；式中y为平均复苏时间(s)，x为丁香酚浓度(mg/L)。随着麻醉剂量的增大，复苏所需的时间也在增加，在高剂量(≥80 mg/L)麻醉剂浓度下，复苏时间超过了Marking等[15]认为的理想麻醉有效浓度，对鱼的影响较大。

图1 不同浓度丁香酚对长薄鳅幼鱼入麻时间和复苏时间的影响Fig.1 Effects of different concentrations of eugenol on anesthesia time and recovery time of juvenile elongateloach

处理浓度(mg·L-1)Concentration麻醉所用时间(s)Anesthesia time复苏所用时间(s)Recovery time范围Range均值Mean范围Range均值Mean复苏率( %)Recovery rate72 h存活率( %)Survival rate of 72 hours20239～278257.20±16.32a167～181172.20±5.93a1001004063～8776.20±10.73b198～227212.20±11.26b1001006043～5352.40±7.13c256～291274.40±13.99c1001008031～5039.60±6.91cd307～351326.00±17.78d10010010025～3930.20±5.54de362～410385.80±17.68e10010012013～3020.40±6.47e433～534486.80±17.18f100100

注：同列数据中具相同小写肩标字母的表示组间无显著差异，具不同小写肩标字母的表示组间差异显著(LSD多重比较，P<0.05)。

Note: There was no significant difference between the groups in the same column with the same lowercase and shoulder acronym, with different lowercase and shoulder acronyms indicating significant differences between groups (LSD multiple comparisons,P<0.05).

2.2 不同浓度丁香酚麻醉剂对长薄鳅幼鱼呼吸频率的影响

如图2所示，当试验鱼放入麻醉液中后，各试验组长薄鳅幼鱼呼吸频率均在短时间呈现出上升趋势，之后在整个麻醉过程中呈现下降趋势；对照组中长薄鳅幼鱼的呼吸频率在整个观察过程中没有出现较大程度的变化。20、40 mg/L试验组长薄鳅幼鱼的呼吸频率在经历了先升后降的过程之后，呼吸频率趋于稳定，在一定的区间内小幅度的变化；60～120 mg/L范围内各试验组中的长薄鳅幼鱼呼吸频率经历小幅上升之后，均呈现直线下降趋势，并进入第Ⅶ期(休克期)。

2.3 在空气中暴露时间长短对深度麻醉长薄鳅幼鱼复苏的影响

由表4可知，以60 mg/L丁香酚将长薄鳅幼鱼麻醉后再在空气中进行暴露，随着暴露时间的增加，复苏所用的时间减少，其中暴露2、4、6 min试验组复苏用时与其它各组存在显著性差异(P<0.05)，而暴露8～26 min试验组之间的复苏用时差异性不显著(P>0.05)。暴露时间在2～24 min范围内的复苏率和72 h存活率均为100 %，当时间增加至26 min时，复苏率降低到了70 %，72 h存活率仅为40 %。

图2 不同浓度丁香酚麻醉剂对长薄鳅幼鱼呼吸频率的影响Fig.2 Effect of different concentrations of eugenol on respiration rate of juvenile elongateloach

2.4 模拟长途运输试验

由表5可知，长薄鳅幼鱼直接放入10 mg/L丁香酚麻醉液中连续浸泡10 h(模式1)，试验鱼始终处于镇静期，复苏率和成活率均为100 %；长薄鳅幼鱼直接放入20 mg/L丁香酚麻醉液中连续浸泡10 h(模式2)，试验鱼始终处于麻醉期，复苏率和成活率均为100 %；长薄鳅幼鱼经60 mg/L的丁香酚麻醉后，立即转入10 mg/L丁香酚麻醉液中连续浸泡10 h(模式3)，试验鱼能够调整身体保持正常状态，可以从麻醉期转入镇静期，之后始终保持在镇静期，复苏率和成活率均为100 %；长薄鳅幼鱼经60 mg/L的丁香酚麻醉后，立即转入20 mg/L丁香酚麻醉液中连续浸泡10 h(模式4)，试验鱼未从麻醉期转入镇静期，反而麻醉程度进一步加深，之后进入休克期，复苏率和成活率均为0。

3 讨 论

3.1 丁香酚对长薄鳅幼鱼麻醉的有效质量浓度

鱼体麻醉后要需经历触觉丧失期、兴奋期和麻醉期这3个时期[16]。在水温(22±1)℃条件下，20～120 mg/L的丁香酚麻醉液均能使长薄鳅幼鱼经历上述3个阶段，且麻醉浓度与与平均入麻时间呈负相关，与平均复苏时间呈正相关。这与丁香酚对苏氏圆腹鱼芒(Pangasiussutchi)[17]和日本黄姑鱼(Nibeajaponica)[18]麻醉效果的研究结果相一致。本试验的研究结果表明20～120 mg/L的丁香酚麻醉液均能使长薄鳅幼鱼进入麻醉阶段，并可以完全复苏，Marking等[15]认为3 min内能够麻醉、并且5 min内能够苏醒是理想麻醉剂的公认标准，按照此标准，40～60 mg/L的丁香酚麻醉液是长薄鳅幼鱼的理想麻醉浓度。此外，麻醉剂的麻醉效果还与鱼体规格、水温、水质等因素有关[19-20]，相关的麻醉效果有待进一步研究阐明。

表4 空气中暴露时间长短对深度麻醉长薄鳅幼鱼复苏的影响

注：表中所示72 h存活率指72 h后存活的试验鱼数量占该组试验鱼总数的百分比。同列数据中具相同小写字母的表示组间无显著差异，具不同小写字母的表示组间差异显著(LSD多重比较，P<0.05)。

Note: The 72 hours survival rate showed in the table refers to the percentage of test fish surviving after 72 hours as a percentage of the total number of test fish in the group. There was no significant difference between the groups in the same column with the same lowercase and shoulder acronym, with different lowercase and shoulder acronyms indicating significant differences between groups (LSD multiple comparisons,P<0.05).

表5 不同运输模式对长薄鳅幼鱼的影响

3.2 丁香酚对长薄鳅幼鱼呼吸频率的影响

呼吸频率因麻醉程度不同而呈现变化。麻醉初期药物首先作用于血液循环系统，呼吸频率稍有变化，随着麻醉时间的延长，药物进入中枢神经系统，从而导致行为能力和呼吸频率均出现明显变化。关于麻醉剂对鱼体呼吸频率的影响，一般认为鱼体呼吸频率呈现先上升后下降趋势，例如鳜(Sinipercachuatsi)[13]、圆斑星鲽(Veraspervariegates)[19]、鲤(Cyprinuscarpio)[21]等。本试验研究结果与其相似，各浓度组长薄鳅幼鱼呼吸频率均呈现先上升后下降趋势，且随着麻醉剂质量浓度的升高，呼吸频率下降越来越快。在丁香酚浓度≤40 mg/L时，长薄鳅呼吸频率下降呈渐变趋势，且后期趋于稳定；在丁香酚浓度≥60 mg/L时，呼吸频率基本上呈现直线下降趋势，且进入休克期。可见麻醉剂剂量对鱼体呼吸频率具有较大影响，这与丁香酚麻醉许氏平鮋(Sebastesschlegelii)[22]、黄腊鲹(Trachinotusblochii)[23]等研究结果相一致。

3.3 空气中暴露时间对长薄鳅幼鱼复苏的影响

研究在空气中暴露时间长短对深度麻醉鱼体复苏的影响，对于活体离水操作具有一定的指导意义[16]。以60 mg/L丁香酚将长薄鳅幼鱼麻醉后再在空气中进行暴露，随着暴露时间的增加，复苏所用的时间减少，这可能是因为在暴露过程中长薄鳅幼鱼在不断的对丁香酚麻醉剂进行代谢导致进入体内的麻醉剂浓度降低造成的，这与丁香酚对苏氏圆腹鱼芒(Pangasiussutchi)[17]和鲫鱼(Carassiusauratus)[20]的麻醉研究结果相似。同时，试验研究表明暴露2～24 min试验各组的复苏率和72 h存活率均为100 %，当暴露时间增加至26 min时，复苏率降低到了70 %，72 h存活率仅为40 %。因此，麻醉后对长薄鳅幼鱼进行称重、测量、体外标记等离水操作时，需将操作时间控制在26 min以内，以确保长薄鳅幼鱼的安全。

3.4 丁香酚在长薄鳅幼鱼长途运输中的安全性

活鱼运输中使用麻醉剂既可以提高成活率又可以有效的增加运输距离[23]。麻醉剂的麻醉剂量对活鱼运输具有重要意义，过高或过低均无法满足运输需求。为了进一步验证丁香酚对长薄鳅幼鱼长途运输的安全性，设计4种模拟长途运输试验，研究结果表明：长薄鳅幼鱼直接放入10 mg/L丁香酚麻醉液中连续浸泡10 h，试验鱼始终处于镇静期，复苏率和成活率均为100 %，这是由于10 mg/L丁香酚麻醉液不能使长薄鳅进入麻醉期，而是长期处于镇静期，既满足了降低长薄鳅幼鱼的代谢，又未产生伤害；长薄鳅幼鱼直接放入20 mg/L丁香酚麻醉液中连续浸泡10 h，试验鱼始终处于麻醉期，复苏率和成活率均为100 %，这种模式虽然复苏率和成活率均为100 %，但在整个试验过程中长薄鳅幼鱼始终处在麻醉阶段，这可能因长期处于麻醉期会对其内脏器官、神经系统造成一定的伤害；长薄鳅幼鱼经60 mg/L的丁香酚麻醉后，立即转入10 mg/L丁香酚麻醉液中连续浸泡10 h，试验鱼能够调整身体保持正常状态，可以从麻醉期转入镇静期，之后始终保持在镇静期，复苏率和成活率均为100 %，这种模式下长薄鳅幼鱼能够从麻醉期转入镇静期，可能是长薄鳅幼鱼在10 mg/L丁香酚麻醉液中能够通过代谢不断的降低体内的麻醉液浓度而未长时间的处于麻醉阶段，对鱼体影响较小，这种模式可以进一步的降低在运输装车、打包等环节的应激反应；长薄鳅幼鱼经60 mg/L的丁香酚麻醉后，立即转入20 mg/L丁香酚麻醉液中连续浸泡10 h，试验鱼没有从麻醉期转入镇静期，反而麻醉程度进一步加深，之后进入休克期，复苏率和成活率均为0，这可能是长薄鳅幼鱼在转入20 mg/L丁香酚麻醉液中后，不能对体内高浓度的麻醉剂进行有效代谢造成的。学者们研究认为深度镇静期是最适宜的运输时期[24-25]。建议采用10 mg/L丁香酚麻醉液和经60 mg/L的丁香酚麻醉后立即转入10 mg/L丁香酚麻醉液的运输模式，对长薄鳅幼鱼的影响较小，适合于长途运输，可推广至实践应用中。

4 结 论

40～60 mg/L的丁香酚麻醉液是长薄鳅幼鱼的理想麻醉浓度；以60 mg/L丁香酚将长薄鳅幼鱼麻醉后对其进行称重、测量、体外标记等离水操作时，需将操作时间控制在26 min以内，以确保长薄鳅幼鱼的安全；采用10 mg/L丁香酚麻醉液和经60 mg/L的丁香酚麻醉后立即转入10 mg/L丁香酚麻醉液的运输模式，可使长薄鳅进入镇静期，且对试验鱼影响较小，推荐作为长薄鳅幼鱼长途运输模式。