蛇足石杉1株产生物碱内生真菌的分离鉴定

张 杰，刘 悦，罗慧琳，张 桥*

(1.齐鲁医药学院 细菌耐药与微生物分子系统学研究室，山东 淄博 255000；2.齐鲁医药学院护理学院，山东 淄博 255000；3.齐鲁医药学院 医学检验技术专业，山东 淄博 255000)

【研究意义】内生真菌是一个具有丰富多样性的生物类群，是人类进行趋利性开发和利用的重要的真菌资源，在各类植物体内广泛分布。植物内生真菌(endophyte)最早由Debary(1866年)[1]提出，鉴于内生真菌与宿主在长期互作过程中与宿主形成了协同进化的关系，而没有引发明显的感染症状，致使关于内生真菌方面的研究成果鲜有报道。自1993年，Strobel 等[2]从短叶紫杉(Taxusbrevifolia) 中分离获得一株能产生紫杉醇(抗癌)的内生真菌，越来越多的人们才逐渐意识到内生真菌与宿主植物间在化学和生态学方面的协同性关系，并对有生物学活性的次生代谢产物投入了更多关注，使得寻找和利用药用植物内生真菌生产具有生物学活性物质而成为微生物学和天然药物化学研究和开发的重要领域。【前人研究进展】蛇足石杉[Huperziaserrata(Thunb.)Trev.]，别名蛇足石松、千层塔等，为石杉科石杉属多年生蕨类草本植物。药学研究表明，蛇足石杉全草含生物碱，其中的石杉碱甲(Hup-A)及其类似物能选择性抑制乙酰胆碱酶的活性[5]，因能起到提高学习记忆功能、改善血管性痴呆患者认知功能等药理作用，对阻止早期老年痴呆进一步发展、维持残存的脑功能、治疗重症肌无力等[6-12]而引起全世界科学家的共同关注，成为治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)最具前景的药物[13-14]。由于众多因素限制，石杉碱甲及其类似物的获得至今仍无法进行工业化生产[15]。因此要解决药源问题，寻找新的途径势在必行。鉴于药用植物内生真菌具有的潜在重要的应用价值，【本研究切入点】本研究从蛇足石杉内分离获得一株产生物碱的内生真菌，【拟解决的关键问题】为蛇足石杉生物碱的综合利用开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试植株 蛇足石杉：供试蛇足石杉[Huperziaserrata(Thunb.) Trev.]健康植株材料于2017年 5月由福建龙岩当地居民采集。

1.1.2 主要试剂与仪器 石杉碱甲对照品购于上海同田生物技术股份有限公司；引物(ITS1和ITS4)由生工生物工程上海股份有限公司合成；薄层色谱硅胶 GF254为青岛海浪硅胶干燥剂厂制造；其他药品为分析纯。

恒温摇床(ZHNY-2112B)，中国天津欧诺公司；Eppendorf AG 5424CP755468高速离心机，德国 Eppendorf 公司；旋转蒸发仪 (RE-2000)，上海亚荣生化仪器厂。

1.1.3 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)，用于植株样品内生真菌的形态研究，培养基中加入 15 μg/mL 链霉素用于分离纯化内生真菌。马铃薯葡萄糖液体培养基(potato dextrose broth，PDB)，用于内生真菌的摇床培养。

1.2 试验方法

1.2.1 内生真菌的分离培养、纯培养和保存 本部分实验操作参考闵长莉等[16]的方法并作了适当的改良。将采集的新鲜蛇足石杉植株先用自来水浸泡和冲洗，然后在无菌室按照如下程序操作：整株蛇足石杉先用75 % 酒精进行浸泡消毒 30 s，无菌水冲洗 4 次，接着用 10 % NaClO 浸泡 5 min，无菌水冲洗 4 次，最后再用75 %酒精浸泡消毒30 s，无菌水冲洗4 次，消毒完成后将根、茎、叶用灭菌镊子和剪刀分开，并用无菌刀片将根和茎切成0.5 cm 大小带斜口的段，叶片切成0.3 cm × 0.3 cm 小块，获得组织块共计100块。将根和茎以斜口面垂直于平板斜插入一半到含 15 μg/mL链霉素的 PDA 平板上，叶片贴覆到含有 15 μg/mL链霉素的 PDA 平板表面，随后倒置于 28 ℃恒温培养箱中进行培养。同时将末次消毒的最后一次冲洗组织块的无菌水涂布在PDA平板表面同样条件下进行培养作为对照用以检验消毒效果。2 d 后逐日观察，无菌操作法挑取在根、茎斜面和叶片切口及与之接触的培养基表面所长出的菌丝，转种到新鲜的 PDA 平板上，对于转种生长繁殖的真菌，挑取菌丝尖端部分再次转种分离纯化，直到获得纯化的内生真菌为止。纯化的内生真菌菌株接种到PDA斜面培养基上经培养后放置于 4 ℃冰箱保藏待用。

1.2.2 内生真菌的液体培养和发酵液粗提物的制备 将分离得到的蛇足石杉内生真菌接种到PDA斜面培养基，28 ℃恒温培养箱中作菌株活化，待其长满斜面后将活化的菌株分别接种于装有100 mL PDL培养基的250 mL锥形瓶中(每个菌株接种3瓶)，置于摇床上，28 ℃，120 r/min 振荡培养10 d。振荡培养10 d 后，在三角瓶中加入100 mL乙酸乙酯，放置于摇床上120 r/min，12 h。之后分装于离心管中，4000 r/min离心10 min，取上清，所得水相继续用等体积的乙酸乙酯萃取2次。合并有机相，然后用旋转蒸发仪减压浓缩至干，再用10 mL乙酸乙酯溶解，取出烘干，最后用 2 mL甲醇溶解，冷冻保存待用。

1.2.3 产石杉碱甲内生真菌的初步筛选 ①生物碱检测。选用碘化铋钾试剂、碘化汞钾试剂、碘-碘化钾试剂和硅钨酸试剂作为蛇足石杉内生真菌发酵液生物碱的检测试剂。取保存的发酵液粗提物0.5 mL于1.5 mL离心管中，共装4管，分别加入3滴生物碱沉淀反应试剂，静置30～60 min后观察结果。②产石杉碱甲内生真菌的筛选。薄层层析法参照 Zhang et al.[17]等方法进行产石杉碱甲内生真菌的初步筛选。层析板采用GF254硅胶板，用毛细管将石杉碱甲对照品溶液、待检样品溶液以及待捡样品溶液和对照品溶液的混合液在硅胶板上分别点样，然后置于层析缸中，展开剂为丙酮∶氯仿∶异丙醇(4∶4∶2，体积比)溶液，在紫外线下照射显示荧光。通过Rf值初步筛选产石杉碱甲的菌株。设置不产生物碱内生真菌发酵液和不接种内生真菌的PDL作为对照组。

1.2.4 蛇足石杉内生菌菌株的形态学研究和鉴定 采用点种法将蛇足石杉内生真菌接种于 PDA平板上置于28 ℃恒温培养，依照真菌的经典分类鉴定方法，进行形态学研究。肉眼观察内生真菌菌落的的宏观形态特征，包括菌落形状、正反面颜色、菌落大小、边缘特征、菌丝性状、生长速度和菌丝体等情况。用透明胶带以菌落中心向边缘的方向粘取菌落的表面菌丝，置于普通光学生物显微镜观察孢子梗、孢子的有无、孢子形状以及孢子颜色或其他产孢结构等微观特征。参考相关菌物分类学专著确定菌株的属种[18-20]。

1.2.5 蛇足石杉内生真菌的分子系统学研究 ①供试菌株基因组DNA的提取。将产生物碱内生真菌种入PDA平板表面，在28 ℃条件下培养3～7 d后刮取菌丝放入灭菌的研钵中，再加入液氮充分研磨，最后用CTAB法提取基因组DNA。②PCR扩增。扩增和测序所用的引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)与ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)(White et al，1990)，上海生工生物工程技术有限公司合成。扩增体系(50 μl)：2×PowerTaqPCR MasterMix(25 μl)；Primer1(2 μl，0.2 μmol/L)；Primer2(2 μl，0.2 μmol/L)；DNA模板(2 μl)；ddH2O(19 μl)。扩增条件：95 ℃ 预变性 3 min；35个循环：94 ℃ 变性 1 min，55 ℃ 复性 1 min，72 ℃ 延伸1 min 20 s；72 ℃ 延伸 10 min。用含G-Red的1.0 % 琼脂糖凝胶对扩增产物检测，然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司青岛分公司进行产物纯化和测序。 ③构建系统发育树。将获得的ITS序列与GenBank/EMBL/DDBJ核酸数据库中已经录入的序列进行BLAST search，并下载数据库中近缘菌株的序列，用于构建系统发育树。用Clustalx1.83进行多序列比对(Alignment)，比对结果利用MEGA6.0软件采用Maxium Likelihood统计学方法构建系统发育树，Bootstrap值设置为1000。

2 结果与分析

2.1 产生物碱内生真菌的筛选

2.1.1 生物碱试剂沉淀法检测 生物碱试剂的沉淀反应结果分别为淡红棕色沉淀、白色沉淀、淡褐色沉淀和白色沉淀。经过筛选，获得均产生沉淀的菌株1株，菌株编号为LYS081(表1)。

2.1.2 薄层色谱法检测 采用GF254硅胶板对内生真菌 PDL 的发酵液粗提物进行薄层层析(TLC)，再用疑似菌株进行第二批次的发酵、萃取和薄层层析(图1)。检测发现，菌株LYS081的发酵液粗提物呈现与 HupA 标准品的迁移率(Rf值)非常接近，其Rf值均为0.5882，石杉碱甲标准品Rf值为 0.6176。但和标准品混合后，在薄层层析结果图上的斑点并没有重合。

表1生物碱试剂与蛇足石杉内生真菌发酵液沉淀反应

Table 1 Precipitation reaction between alkaloid reagents and broth produced by endophytic fungi fromHuperziaserrata

MLYS02LYS081碘化汞钾--+硅钨酸--+碘-碘化钾--+碘化铋钾--+

注：+：产生沉淀；-：不产生沉淀;M：PDB培养基提取物。

Note: +: Positive results; -: Negative results.

C：石杉碱甲标准品；1：PDB培养基提取物；2、4：分别为菌株LYS02、LYS081培养滤液提取物；3：菌株LYS081培养滤液提取物与石杉碱甲标准品混合物C: Standard HupA sample; 1: The extracts of potato dextrose medium; 2, 4: Metabolite of strain LYS02, LYS081; 3: The mixture of HupA and metabolite of strain LYS081图1 蛇足石杉内生菌PDB中发酵液提取物的TLCFig.1 TLC analysis of extracts of fermentation by Huperzia serrata endophytic fungi in PDB

2.2 蛇足石杉内生菌菌株的形态学特征和鉴定

菌株LYS081在PDA平板上经28 ℃的恒温暗培养，4 d 后菌落直径85 mm，生长速度快。菌落正面白色，絮状菌丝，菌落中心气生菌丝有逐渐消失趋势，背面米黄色(图2A、B)。菌丝有隔，色浅，宽4～10 μm(图2C)。分生孢子梗单生(图2D、F)，有分枝(图2D)，长约20～30 μm，瓶梗单个或簇生，在瓶梗顶端产生瓶梗孢子(图2D、E)，瓶梗孢子聚集成头部(图2E、F)，瓶梗孢子单细胞，圆形或卵圆形，色浅，透明或半透明，瓶梗孢子大小为3～5 μm。经查阅相关菌物学专著文献[18-20]，发现以上特征符合木霉属(Trichoderma)真菌的形态特征，形态学确定隶属于木霉属(Trichoderma)。

2.3 基于ITS 序列的分子系统学分析

将获得的ITS序列与GenBank/EMBL/DDBJ核酸数据库中已经录入的序列进行BLAST search，并下载数据库中近缘菌株的序列，同时将该序列录入核酸数据库，获得登录号(accession number)MH321525.1，该序列和下载序列一并用于构建基于rDNA ITS序列的系统发育树(图3)。

菌株LYS081在系统树上与康宁木霉[Trichodermakoningiopsis(KY568699.1)]聚在一起，支持率86 %，他们之间的相似性很高，达到了99 %，说明有着很高的同源性，在发育关系上有着很近的距离。LYS081和参考株康宁木霉[Trichodermakoningiopsis(KY568699.1)]的遗传距离有0.0248，大于0.01，存在较大的分歧。综合系统发育分析和序列遗传距离数据，结合形态学特征，菌株LYS081隶属于木霉属(Trichoderma)，较难鉴定到种，明确界定种属需要进一步的分析和研究。

A、B：在PDA平板上28 ℃培养形成色白色菌落，85 mm/4d，A正面，B反面；C：菌丝，菌丝有隔；D、E和F：产孢结构，分生孢子梗单生，有分枝，瓶梗簇生，分生孢子聚集黏连成头部；G：分生孢子，单细胞，圆形或卵圆形。A、B标尺为20 mm；C、D、E、F、G为10 μmA and B: Forming white colony on PDA culture medium at 28 ℃ for 4 days, A: The obverse side, B: The reverse side; C: Hypha,septate hypha; D,E and F: Spore-formed structure; G: Conidia. Bars: A and B=20 mm; C, D, E, F and G=10 μm图2 蛇足石杉内生真菌LYS081的菌落、产孢结构及分生孢子形态Fig.2 Morphological characters of strain LYS081

菌株名或种名后的括号为序列的登录号；系统树内节点处的数字表示bootstrap检验值；标尺刻度代表序列差异The accession number is shown in parenthesis; Numbers at the branch points indicated the value of bootstrap test support based on 1000 sets; The scale bar means sequence difference图3 LYS081基于rDNA ITS序列的系统发育树Fig.3 LYS081 phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence

3 讨 论

植物内生真菌与宿主在长期互作用中逐渐演化形成了一种互惠共生的关系，可产生与植株相似，甚至相同的具有生物活性的次生代谢产物，开发和利用内生真菌产具有生物学活性的物质成为目前国内外研究的新领域和热点。木霉属(Trichoderma)真菌菌属于半知菌亚门(Deuteromycotina)丝孢纲(Hyphomycetes)丛梗孢目(Moniliales)丛梗孢科(Moniliaceae)，广泛存在于自然界。Weindling[21](1932年)研究发现木霉属真菌有着对植物病原真菌的拮抗作用，开发和利用木霉菌进行生防有了较大进展。据报道，木霉属真菌对Rhizoctoniasolani、Fusariumspp、Sclerotiumrolfsii和Phythiumspp.等植物病原菌具有拮抗作用[22-23]；魏洪璇等[24]报道哈茨木霉(Trichodermaharzianum)发酵液具有广谱抗菌活性和抗肿瘤活性。

生物碱是一类广泛存在于生物界重要的天然化合物，有着显著的生物学活性。现有报道表明，植物内生真菌能够产生数十种生物碱，这些生物碱具有拮抗病原菌、拮抗线虫等多种生物学活性。随着1993年，Strobel 等[2]从短叶紫杉(Taxusbrevifolia) 中分离获得一株能产生紫杉醇(抗癌)的安德氏紫杉霉(Taxomycesandreanae)内生真菌，发现越来越多的植物内生真菌能产生和宿主植物相同或相似的活性物质。如，抗肿瘤药物喜树碱[25]、抗菌和抗肿瘤活性的吲哚二酮哌嗪类生物碱[26]、收缩血管效用的麦角类生物碱[27]、乙酰胆碱酯酶高抑制活性的石杉碱甲[28]等。本研究中，对分离获得的蛇足石杉内生真菌进行生物碱和疑似产石杉碱甲的菌株进行初步筛选，发现菌株LYS081能合成生物碱。该菌株产生的生物碱是什么，有什么样结构，有无乙酰胆碱酯酶抑制活性、或有无拮抗植物病原菌活性、或有无抗肿瘤活性，活性机制是什么，其产量如何，遗传稳定性如何，都值得进一步研究，这将为利用内生真菌发酵生产乙酰胆碱酯酶抑制性物质提供新的菌种支持。