以硼和苯基共掺杂的石墨相氮化碳纳米片为模拟酶的过氧化氢荧光传感器

钟坚海，陈 靖，黄建立，陈 宜，张艳燕，温建荣，苏雪香，郭良洽*

(1.龙岩出入境检验检疫局综合技术服务中心，福建 龙岩 364000；2.福州大学 食品安全与生物分析教育部重点实验室，福建 福州 350116；3.福建省粮油质量监测所，福建 福州 350012)

过氧化氢，俗称双氧水，可用作食品加工助剂，具有消毒、杀菌、漂白等功能。由于双氧水对人的皮肤、眼睛和黏液膜有刺激作用，其蒸气进入人体呼吸系统后，可对肺部产生刺激作用，甚至严重损伤器官。世界卫生组织国际癌症研究机构也将其列为3类致癌物，过量使用或滥用双氧水可能对人体造成严重影响，因此我国对其使用有严格的规定。食品中过氧化氢的测定方法主要有滴定法[1]、分光光度法[2]、色谱法[3]、化学发光法[4]、电化学法[5]等，上述方法大多存在操作复杂、受干扰因素影响大、检出限高等问题，难以满足检测需求，因此丞需设计和开发新型的过氧化氢检测方法。

模拟酶是人工方法合成的具有酶催化性质的一类催化剂，相对于生物酶，模拟酶具有成本低、性能稳定、不易失活或被蛋白质酶分解等优势，受到了人们的极大关注。自2007年首次发现四氧化三铁磁性纳米颗粒[6]具有过氧化物酶的催化活性以来，其他纳米材料包括金属硫化物[7]、金属氧化物[8-9]、金属纳米材料[10]、碳纳米材料[11-12]等也被报道具有过氧化物酶活性。其活性与样品中存在的痕量金属催化剂无关，而是由材料自身的固有性质决定[13]。纳米材料的成本低、稳定性高以及催化性能可调，使得这些纳米材料组成的过氧化物模拟酶广泛应用于生物和医学诊断领域[14]。近年来，人们发现石墨相氮化碳(g-C3N4)可催化过氧化氢分解产生羟基自由基，进而通过羟基自由基与过氧化物酶底物如3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、邻苯二胺(OPD)的颜色反应设计出H2O2、葡萄糖、尿酸等的传感器[15-17]。为了进一步提高g-C3N4的催化性能，通常可以采取掺杂的方式来调节电子带隙，或者通过与其他纳米材料杂化构建纳米复合物的策略来实现[18-20]。然而，通过g-C3N4与非金属元素的掺杂来实现过氧化物模拟酶活性的研究鲜有报道，本研究采用“结构掺杂”的方法制备得到硼和苯基共掺杂的石墨相氮化碳纳米片，并利用其催化过氧化氢氧化荧光底物Amplex Ultrared试剂(AUR)生成高荧光物质试卤灵的反应，设计了一种新型过氧化氢荧光传感器。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Tecnai G2F20型透射电子显微镜(TEM，美国FEI公司)，Rigaku Ultima IV型X射线衍射仪(XRD，日本理学公司)，Nano ZS90纳米粒度及Zeta电位分析仪(英国马尔文公司)，Multimode NanoScope IIId型原子力显微镜(AFM，美国Bruker公司)，F-4600荧光分光光度计(日本Hitachi公司)，ZF-20D 暗箱式紫外分析仪(巩义市予华仪器有限责任公司)。

氰胺溶液(50%)、3-氨基苯硼酸、氟化氢铵以及二氧化硅溶胶(12 nm，40%)购自Sigma-Aldrich公司。H2O2、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠购自国药集团化学试剂有限公司。Amplex Ultrared试剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司。所有试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 BP-C3N4材料的制备

硼和苯基共掺杂的石墨相氮化碳纳米片(BP-C3N4)材料的合成步骤如下：将0.03 g的 3-氨基苯硼酸溶解在4 g 氰胺液体中，随后加入8 g 二氧化硅溶胶，将混合物置于60 ℃下搅拌过夜以除去溶剂。在氮气氛围下，将所得浅黄色粉末以4.5 ℃/min 的速率加热至600 ℃，并保持4 h，自然冷却。最后将所得棕红色粉末用4 mol/L NH4HF2溶液处理24 h 以除去二氧化硅模板。所得混合溶液在1 000 r/min下离心15 min，将沉淀重新分散在水中并透析除去多余的NH4HF2(透析袋截留分子量：3 500 D)。此后，再次离心并将粉末重新分散在50 mL 水中超声处理24 h后，离心并将沉淀物真空冷冻干燥,得到BP-C3N4材料。

1.3 H2O2荧光检测

取50 μL 磷酸盐缓冲液(10 mmol/L，pH 6.0)和50 μL AUR(20 μmol·L-1)，混合均匀后加入100 μL BP-C3N4(0.2 mg·mL-1)和300 μL不同浓度的H2O2溶液，于旋涡混匀器上混匀。将混合溶液置于水浴恒温振荡器中于35 ℃ 800 r/min转速下避光振摇30 min后，测定混合溶液的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 BP-C3N4的表征

参照已有文献方法[19]，以SiO2纳米颗粒为模板，通过热聚合3-氨基苯硼酸和氰胺得到BP-C3N4和SiO2的复合纳米材料，进一步经NH4HF2处理后，采用超声剥离的方法得到所需的BP-C3N4材料。透射电镜(TEM)结果表明，BP-C3N4呈不规则的带状(图1A)，宽度约5～50 nm。AFM结果显示其厚度约为8～15 nm(图1B)，平均厚度约12 nm。采用纳米粒度及Zeta电位分析仪测得其粒径约130 nm(图1C)，pH 7.0时Zeta电位为-39.3 mV。XRD分析结果(图1D)表明，相对于纯的g-C3N4，BP-C3N4在27.5°只有一个较弱的层间(002)衍射峰，且峰形变宽，这是由超声剥离导致片层厚度变薄引起。此外，硼和苯基的掺杂使其在13.3°处的面内(100)衍射峰基本消失[19]。

图2 不同溶液的荧光光谱图Fig.2 Fluorescence spectra of different solutionsa.AUR+BP-C3N4，b.AUR+H2O2，c.AUR+ BP-C3N4+H2O2

2.2 BP-C3N4的模拟酶活性

采用荧光底物Amplex Ultrared试剂(AUR)作为荧光探针，对BP-C3N4催化H2O2氧化AUR的模拟酶活性进行了研究。图2给出了BP-C3N4、H2O2以及BP-C3N4和H2O2同时存在时AUR的荧光光谱图。只加入BP-C3N4或H2O2时，AUR的荧光强度无明显变化(曲线a和b)，此时紫外灯照射下肉眼观察不到荧光。然而H2O2和BP-C3N4同时存在时，AUR在590 nm处出现强荧光(曲线c)，且紫外灯下可观察到明显的橙红色荧光。上述结果表明，单独的BP-C3N4或H2O2不会氧化AUR，而两者同时存在时，由于BP-C3N4具有过氧化物模拟酶催化活性，可以催化H2O2与AUR反应生成高荧光的试卤灵。其可能的机理为：AUR通过π-π相互作用吸附到BP-C3N4的表面，其孤对电子先后转移给BP-C3N4和H2O2并产生羟基自由基(·OH)，从而使得AUR更容易被氧化，而硼原子和苯环的掺杂可以提高电荷分离效率，有利于提升材料的稳定性和催化活性[17,19-20]。

2.3 反应时间的影响

实验研究了不同反应时间下体系荧光强度的变化情况。发现随着时间的延长，体系的荧光强度快速增大，随后增速变缓，大约在30 min后趋于稳定。本实验最终选择30 min作为传感体系的反应时间。

2.4 体系pH值的影响

pH值对类过氧化物酶的催化活性有重要影响，分别考察了pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸盐缓冲液对体系荧光强度的影响。结果显示，随着溶液pH值的增大，体系的荧光强度一开始随着pH值的递增而递增，在约pH 6.0时强度最高，随后开始下降，表明在溶液呈中性偏酸条件下更有利于AUR的氧化[8]，考虑到传感体系的稳定性和BP-C3N4的催化活性，控制反应体系的pH值为6.0。

2.5 温度的影响

考察了不同温度下体系荧光强度的变化。发现随着温度的升高，体系的荧光强度逐渐增大，在35 ℃时达到最大值，随后逐渐减小，这与已报道的其他纳米材料及天然过氧化物酶催化的适宜温度类似[17,21]。因此最终选择体系的反应温度为35 ℃。

2.6 H2O2的荧光检测

基于BP-C3N4内在的过氧化物模拟酶催化活性，建立了一种新型的荧光传感方法。考察了H2O2浓度为0～600 μmol/L时体系荧光光谱的变化情况，结果显示，体系的荧光强度随着H2O2浓度的增加而逐渐增强，在100 μmol/L以后趋于稳定。过氧化氢浓度(x)在0～100 μmol/L范围内与荧光强度(y)呈线性关系，线性方程为y=8.801 8x+112.09，r2=0.992 2。基于空白实验3倍标准偏差的方法计算得出方法的检出限为1.1 μmol/L。

2.7 方法的选择性

2.8 实际样品中H2O2含量的检测

经不同浓度过氧化氢溶液浸泡处理过的腐竹样品晾干后，以水浸泡提取，分别采用本方法和双氧水检测试纸法对残留过氧化氢进行检测，结果见表1。从表1数据可见，本方法测得的结果与试纸法的结果一致，但本方法的灵敏度优于试纸法，且通过测定荧光强度可以准确定量检测H2O2残留量。

表1 不同浓度过氧化氢溶液浸泡处理过的腐竹样品残留检测结果Table 1 The results for the detection of H2O2 residues in the dried bean milk cream in tight rolls samples after soaked in different concentrations of H2O2 solutions (mg/kg)

2.9 与其他方法的比较

将本方法与已报道的基于g-C3N4模拟酶催化活性的H2O2检测方法进行比较，结果见表2。从表2可以看出，与未掺杂的g-C3N4相比，本方法具有线性范围宽、检出限较低等优点。

表2 与其他过氧化氢检测方法的对比Table 2 Comparison with other methods for determination of H2O2

(续表2)

CatalystLinear range(μmol/L)Detection limit(μmol/L)ReferenceCu2+-g-C3N4NPsg-C3N4-Fe3O4MnSe-g-C3N4Se-g-C3N4/BP-C3N40～1 0001～4018～1 80016～4 0000～600400.31.81.61.1[22][23][24][25]This work

3 结 论

实验发现硼和苯基共掺杂的石墨相氮化碳具有过氧化物模拟酶的内在催化活性，BP-C3N4可以催化H2O2氧化AUR生成强荧光的试卤灵，使反应体系的荧光增强，基于该原理设计了一种新型H2O2传感器。研究结果表明，该传感体系的荧光强度与反应时间、缓冲液pH值、反应温度有关，荧光强度与过氧化氢浓度在0～100 μmol/L范围内呈线性关系，检出限为1.1 μmol/L，对实际样品的检测结果与常用的试纸法一致。与现有方法相比，此法具有容易操作、选择性好、灵敏度高等特点。此外，传感体系所产生的荧光在紫外灯的照射下还可通过裸眼直接观察，有望通过目视比色的方法实现过氧化氢的现场快速检测。