细菌源追踪技术在杨家河水域枯水期的应用

李正洁，程汉超

（山东省环境保护科学研究设计院有限公司，济南250012）

1 引言

本研究选取南四湖流域光府河支流杨家河段为研究对象。对研究对象枯水期进行取样和分析，研究水体中大肠杆菌种类与周边污染物的关系。

2 样品采集

已知源样的采集：采样选择在光府河支流杨家河周边的王桥村、孙桥村和南营村，在村内采样优先采取污染贡献率比较大的采样点，如养鸭场和养猪场，然后依次安排，村内采样具体地点选择随机分散。

水样的采集：在杨家河王桥段和杨家河桥段沿河流走向采集水样，采集水样20份。

3 实验部分

3.1 人和动物粪便样本中大肠杆菌的分离

粪便样本直接划线接种伊红美蓝琼脂平板36℃培养24h，每个样本挑取3个深紫黑色、具有金属光泽，且革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌的菌落，转种于TSA上36℃培养24h，然后使用Vitek 2 Compact鉴定系统进行鉴定，凡鉴定为大肠杆菌阳性者，保存于磁珠冻存管中（-80℃）。

3.2 脉冲场凝胶电泳（PFG E）分型试验

从检测培养基上挑取单菌落，接种于TSA平板上培养，37℃孵育箱培养14h；用同一个接种针/环，穿刺或接种于小螺帽管中的TSA培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。同时接种标准株H9812，依次进行细菌包埋、细菌裂解、清洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样、电泳、图像获取、图像分析。

3.3 水中总大肠菌群的测定和大肠杆菌的分离

取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，然后取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样注入9mL生理盐水中，混匀后吸取1mL（即0.1 mL水样）注入10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度5管。

将接种管置36℃培养箱中，培养24h，如计数产酸产气管数，将产酸产气管分别接种到2个伊红美蓝琼脂平板上36℃培养24h，观察菌落形态，挑取符合深紫黑色、具有金属光泽的菌落，紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落或淡紫红色、中心较深的菌落作革兰氏染色实验，若革兰氏染色阴性无芽胞杆菌的则进一步接种单料乳糖蛋白胨培养液36℃培养24h，复发酵。以上试验全部阳性者记录为阳性管数，查MPN（最大可能数）检索表，记录100mL水样中的总大肠菌群MPN值。

挑取上文所述伊红美蓝琼脂平板生长的深紫黑色、具有金属光泽，且革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌的菌落，转种于TSA上36℃培养24h，每份水样随机挑取2支阳性发酵管对应平板，挑取3个菌落，使用Vitek 2 Compact鉴定系统进行鉴定，凡鉴定为大肠杆菌阳性者保存于磁珠冻存管中（-80℃）。

3.4 脉冲场凝胶电泳（PFG E）分型试验

水中大肠杆菌脉冲场凝胶电泳分型试验与人及动物粪便样本中大肠杆菌的分型试验操作程序相同。

4 结果和讨论

4.1 样本采集结果

枯水期采集水样20份，采集人及动物粪便样本24份，具体采样情况如表1所示。

表1 样本采集情况

4.2 水中总大肠菌群的测定结果

枯水期水样中检测到总大肠菌群的存在，具体结果如表2所示，表明该流域水样均受到了人或动物粪便的污染。

4.3 枯水期PFG E分型结果

通过对枯水期水样的分型结果进行分析可知，枯水期杨家河水体的污染源为鸭源53.3%，猪源30.0%，人源1.7%，未知源的为15%。

表2 水体总大肠菌群测定结果

4.4 讨论

本次试验人和动物粪便选取杨家河周边的王桥村、孙桥村和南营村，采集鸭粪便10份、猪粪便10份、人粪便4份。水样采取选取洸府河支流杨家河王桥段和杨家河桥段，采集水样20份。

通过PFGE分型结果发现：

1）枯水期水样中检测到总大肠菌群的存在，每100ml水样中总大肠菌群MPN值为在79～920，表明该流域水样均受到了人或动物粪便的污染。枯水期20个水样中，仅3个水样中总大肠菌群数满足GB 3838—2002《地表水环境质量标准》II类标准（≤2000个/L）要求。14个水样中的总大肠菌群超过了GB 3838—2002《地表水环境质量标准》II类标准（≤2000个/L）要求，但满足III类标准要求，有4个水样中总大肠菌群数达到9200个/L，接近于10000个/L标准。有3个水样中总大肠菌群数量高达1.6×104个/L，仅满足GB 3838—2002《地表水环境质量标准》IV类标准（≤2000个/L）要求。

2）枯水期的杨家河水体的污染源为鸭源53.3%，猪源30.0%，人源1.7%，未知源的为15%。

现场调查发现，杨家河段河流两侧有数家养猪场、养鸭场，养殖场存在粪便随意堆放、污水直接排放的现象，没有经过统一收集和集中处理，尤其有2家养鸭场，距杨家河较近，粪便极易通过雨水进入水体，污染环境，与PFGE分型结果中鸭源占比较高一致。

5 结论

利用细菌源追踪技术对南四湖水域洸府河支流杨家河段水体细菌源进行鉴别、评估，将非点源污染控制转化为点源污染控制，为山东省水资源保护、监督管理提供了科学依据和技术支持，在山东省乃至全国的水资源保护中都将起到示范作用。