咳喘宁对RSV诱发哮喘豚鼠肺TLR4及NF-κB mRNA的影响

罗显锋，董晓斐，屈 波

（1．湖南中医药大学2018级硕士研究生，湖南 长沙 410208；2．湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007；3．湖南中医药大学组织胚胎学研室，湖南 长沙 410208）

支气管哮喘（简称哮喘）是一种以慢性气道炎症和气道高反应性为临床表现的疾病［1］。呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytia Virus，RSV）是人类呼吸道感染的重要病原体之一，其感染与哮喘的发病、加重存在明显的相关性，是引起儿童哮喘常见的病原体［2］。TLR4（Toll-like receptor 4，TLR4）为Toll样受体家族中的一员，能识别细菌、病毒和环境中相应抗原的保守结构，从而启动天然免疫和调节性免疫应答，在细胞活化信号的传导中起重要作用［3］。TLR4广泛存在于气道上皮、单核/巨噬和嗜酸性粒等细胞中。TLR4的特异性配体是双链RNA（double stranded RNA，dsRNA），RSV在复制和转录过程中可产生大量dsRNA，因此RSV可作为TLR4的配体。当支气管上皮细胞受到RSV感染时，TLR4与dsRNA结合，可经由MyD88依赖性或非MyD88依赖性途径使核因子-κB（NF-κB）迅速移位于细胞核内，诱导炎症细胞产生IL-1、IL-6、IFN-γ、TNF-ɑ、ICAM-1等炎性因子，导致气道炎症的发生［4］。

经多年的实验研究及临床应用，咳喘宁口服液治疗病毒诱发儿童哮喘有较好疗效［5］。本实验通过RSV悬液滴鼻感染结合OVA雾化吸入的方法建立哮喘豚鼠模型，通过对比不同组别豚鼠肺组织TLR4及NF-κB mRNA表达水平的变化，进一步探究咳喘宁口服液在支气管哮喘治疗中所发挥的作用机制。

1 材 料

动物。清洁级豚鼠60只，雌雄各30只，体质量250±50g，购于湖北天勤实验动物科技有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2014-0010。

药品及试剂。咳喘宁口服液（炙麻黄、杏仁、桃仁、大青叶、黄芪、生石膏、细茶和甘草，每瓶100mL，每毫升含生药1.0g，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供）RSV病毒悬液（武汉东新阳生物技术有限公司），卵清白蛋白（Solarbio公司），DEPC水（大连美仑生物科技有限公司），TRIzol（Thermo公司），逆转录试剂盒（Thermo公司），扩增试剂盒（Takara公司）。引物由上海生工生物工程有限公司合成，TLR4上游引物5'-TAGACGTGCAACGAGAAGGG-3'，下游引物5'-CCAAGGAAGGAGTACAGCCC-3'；NF-κB上游引物5'-GCCCAGCCTTACTCGACTTT-3'，下游引物5'-AAGCTCACGTCCAGACACTG-3'；β-actin上游引物5'-GATCTGGCACCACACCTTCT-3'，下游引物5-CATCTTCTCACGGTTGGCCT-3'。其余试剂为市售分析纯试剂。

主要仪器及设备。石蜡切片机（型号Finesse 325，由英国Shando公司提供），分光光度计（由英国BioDrop公司提供），普通PCR仪（由美国Bio-Rad公司提供），荧光定量PCR仪（型号Realplex2，由德国艾本德公司提供），高速台式冷冻离心机（型号Z23HK，由德国HermLe公司提供）。

2 方 法

模型的制备及分组。清洁级豚鼠60只，体质量（250±50）g，适应性喂养1周后，随机抽取10只作为空白组，余下50只按照文献报道的方法复制RSV诱发的哮喘［6］：用滴度为1.0×106空斑形成单位的RSV悬液250μL滴鼻，第2日相同剂量加强1次。第7日开始给予1g/mL OVA隔天雾化吸人，每次30min，持续2周，当豚鼠出现喷嚏、鼻腔有少量卡他样无色透明分泌物、弓肩耸背、点头样呼吸、腹肌抽搐、甚至站立不稳时即为哮喘急性发作，提示造模成功。造模成功后将50只豚鼠按随机数字法平均分为模型组，咳喘宁高、中、低剂量组，西药对照组，每组10只。

给药。各组均从造模2周后开始雾化治疗，雾化时间均为7天，每天雾化2次，每次20min。咳喘宁组以咳喘宁口服液雾化，设置低、中、高剂量组，每次剂量分别为0.4g/kg、0.8g/kg、1.2g/kg将其加蒸馏水使雾化总量均为20mL。西药对照组以地塞米松和利巴韦林雾化吸入，利巴韦林剂量为0.45mg/kg，地塞米松剂量为0.7mg/kg，溶于蒸馏水使雾化总量均为20mL。模型组及空白对照组以等量蒸馏水雾化吸入。雾化治疗时间均为7天，在治疗过程中，模型组豚鼠死亡4只，咳喘宁中剂量组豚鼠死亡2只，咳喘宁低剂量及西药对照组豚鼠各死亡1只，咳喘宁高剂量组及空白对照组豚鼠无死亡，所有动物在雾化治疗7天后处死取材。

取材。末次激发24h后予10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉并处死，取出其肺组织并分离左右肺。左肺放入4%多聚甲醛中固定，右肺放入冻存管中，-80℃保存。

病理检测。取出4%多聚甲醛中固定好的肺组织，切成0.5cm×0.5cm×0.2cm大小的切块，进行脱水、包埋、切片，采用HE染色法染色后以中性树胶封片，在显微镜下观察豚鼠肺组织的形态学变化。

豚鼠肺组织TLR4及NF-κBmRNA水平测定：采用实时荧光定量PCR检测TLR4及NF-κBmRNA的表达水平。①RNA提取：剪取约100 mg的豚鼠肺组织，在液氮研磨成碎片状，并加入1 mL TRizol裂解组织，然后离心去除未完全裂解的组织；加入0.2 mL氯仿，离心，取上清液；加入0.5 mL异丙醇，弃上清液；加0.1mL 75%乙醇清洗，弃上清液，重复2～3次；室温放置5～10 min，使沉淀物干燥后，加10～25μL DEPC水，-80℃保存。②RT反应：1～5µg RNA、10μmol/L Oligo（dT） 1µL、DEPC水补足至12µL，点动离心；在水浴锅上65℃加热5 min，冰浴3 min；加5×反应缓冲液4.0μL、10 mmol/L dNTP Mix 2µL、RiboLock™ RNA酶抑制剂 1μL，RevertAid™ M-MuLV 逆转录酶1μL，PCR仪上42℃加热60 min，70℃ 5min；上述反应液即为cDNA，-80℃保存。③PCR反应：cDNA作为荧光定量模板，使用TB Green试剂盒，按照说明书配制反应液，在荧光定量PCR仪上设置反应模式：95℃ 3min预变性、95℃ 10s、58℃ 30s、68℃ 20s循环40次，再加入溶解曲线后结束。读取Ct值并分析结果。

3 结 果

各组豚鼠肺组织病理变化。正常组豚鼠肺组织无明显炎症细胞浸润，支气管结构基本完整，管壁无明显增厚。模型组豚鼠支气管结构明显紊乱，管壁明显增厚，有炎症细胞浸润。药物治疗组豚鼠肺组织病理变化均有所改善，其中西药对照组及咳喘宁高、中剂量组改善程度优于咳喘宁低剂量组（见图1）。

图1 6组豚鼠肺组织HE染色（200×）

各组豚鼠肺组织TLR4及NF-κBmRNA的表达变化。与空白对照组比较，模型组豚鼠肺组织中TLR4及NF-κBmRNA的表达明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，西药对照组及咳喘宁治疗组豚鼠肺组织TLR4及NF-κBmRNA的表达明显降低（P＜0.05），其中西药对照组、咳喘宁高、中剂量组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 各组豚鼠肺组织TLR4及NF-κBmRNA的表达量变化 （±s）

表1 各组豚鼠肺组织TLR4及NF-κBmRNA的表达量变化 （±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别 例 TLR4 NF-κB空白对照组 6 1.01±0.01 1.01±0.01模型组 6 1.12±0.10* 1.12±0.10*西药对照组 6 1.03±0.03△△ 1.02±0.02△△咳喘宁高剂量组 6 1.01±0.02△△ 1.02±0.03△△咳喘宁中剂量组 6 1.03±0.02△△ 1.02±0.02△△咳喘宁低剂量组 6 1.04±0.04△ 1.03±0.01△F 2.954 3.369 P 0.045 0.029

4 讨 论

气道慢性炎症是哮喘基本的病理特征，TLR4是一种主要的天然免疫模式识别受体，在免疫应答和炎症反应中起重要作用。TLR4在识别多种病原微生物的病原相关分子模式（ PAMPs） 后可激活TLR4信号转导通路，通过MyD88依赖性或非 MyD88 依赖性信号途径，解除NF-κB的抑制状态［7］。而NF-κB是一种重要的、多向性转录调节蛋白，在调控、转录细胞因子与促炎基因的表达中起到重要作用。NF-κB被激活后，进入细胞核内诱导特定部位的炎性因子基因的表达，激活IL-1、IL-5、IL-6、IL-8、IL-13、IFN-γ、TNF-α、ICAM-1等各种炎性介质的表达，并导致IgE的升高［8］。同时，激活的NF-κB可反过来促进TLR4的表达，形成相互促进的正反馈循环［9］。因此，当人体呼吸道受到RSV感染时，TLR4/NF-κB信号通路可被激活，使气道上皮产生大量的炎症因子、趋化因子，从而导致气道炎症、气道高反应和气道黏液高分泌，引起支气管哮喘的发生、发展。

支气管哮喘属中医“哮喘”范畴。《丹溪心法·喘论》首次提出了“哮喘”之名，并提出“哮喘专主于痰”。中医认为，哮喘的发生机理与外邪触发体内伏痰有关［10］。历代治喘名家大都认为“伏痰”与哮喘密不可分，可将哮喘的发病机理概括为“外因诱发，触动伏痰，痰随气升，气因痰阻，相互搏结于气道”，因此平喘祛痰尤为重要。

咳喘宁口服液是湖南中医药大学第一附属医院的自制药物，是由五虎汤化裁而成的，五虎汤来源于《仁斋直指方》，主治风热壅肺、咳喘痰多者。方中麻黄味辛、微苦，性温，既可疏风解表，又能宣肺平喘，其主要成分麻黄碱有抗炎、缓解支气管平滑肌痉挛的作用；杏仁味苦，归肺、大肠经，具有止咳平喘、肃降肺气之功效。两药配伍，一宣一降，调畅气机，共为君药。石膏味辛、甘，性寒，归肺、胃经，清泄肺热；大青叶味苦，性寒，归心、胃经，功在清热泻火，其主要化学成分叶含靛，具有抑制炎症反应及抗病毒的作用；黄芪味甘，性微温，归肺、胃经，可补气健脾，益卫固表，增强机体免疫力；三药合用，清泄肺热、健脾益气，扶正以驱邪外出，共为臣药。桃仁味苦、甘，性平，归心、肝、大肠经，活血化瘀，改善炎症病灶，且可止咳平喘；细茶叶味苦、甘，性寒，功在醒神化痰；甘草味甘，性平，补气益中，镇咳平喘，并可调和诸药，共为佐使。诸药合用，共奏发表清热、化痰平喘、活血化瘀功效。

既往实验研究发现，咳喘宁口服液可通过降低大鼠肺组织中TLR4及NF-κBP65的表达来降低气道炎症反应［11］，李英、谭维等［12-13］通过制作RSV诱导的哮喘大鼠模型，分别使用蒸馏水、醋酸泼尼松片加硫酸沙丁胺醇及咳喘宁口服液治疗，发现咳喘宁可抑制哮喘大鼠嗜酸性粒细胞（EOS）浸润，上调IFN-γ的水平，降低IL-4、IL-17、IL-8及IgE的表达，从而降低气道炎症反应，其疗效与西药相当。因此可推测TLR4/NF-κB信号通路与RSV所诱发的哮喘关系密切，咳喘宁口服液可能通过该通路抑制气道上皮炎症因子的产生来降低气道的炎症反应，抑制哮喘的发生、发展。本实验通过对RSV诱发的哮喘豚鼠进行分组治疗，结果表明咳喘宁可减轻RSV所诱发的哮喘豚鼠气道炎症，降低其肺组织中TLR4、NF-κB mRNA的水平，其疗效与西药相当，但作用与药物剂量相关。因此，推测咳喘宁可通过抑制哮喘豚鼠TLR4、NF-κB的表达，从而减少炎性因子的产生，减轻气道的炎性反应，以达到缓解症状、治疗哮喘的作用。