奶牛卵巢中一株IBRV的分离鉴定

程凯慧 朱彤 任亚初 张云飞 楚会萌 解晓莉 张亮 杨宏军

摘要：利用MDBK细胞从奶牛卵巢中分离到一株牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）毒株。设计扩增IBRV的通用引物，对卵巢组织中的病毒进行PCR 扩增及测序;对卵巢组织感染MDBK细胞，进行IBRV的分离培养;测定IBRV的TCID 50，同时利用IBRV FA 进行鉴定。结果表明，分离到的病毒在MDBK细胞上产生了明显的病变;用特异性引物可扩增出特异性目的条带，目的序列与IBRV基因序列一致;该毒株的病毒滴度为106.75 TCID 50/mL。

关键词：卵巢;牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）;鉴定;细胞病变;TCID 50

中图分类号：S852.65+9.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）02-0117-04

Isolation and Identification of an IBRV Strain from Cow Ovary

Cheng Kaihui， Zhu Tong， Ren Yachu， Zhang Yunfei，

Chu Huimeng， Xie Xiaoli， Zhang Liang， Yang Hongjun

（Dairy Cattle Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 25013 China）

AbstractA strain of IBRV was isolated from cow ovary with MDBK cells. The universal primer of IBRV was designed and amplified， and the ovarian tissue was used for PCR and sequencing. The ovarian tissue infected MDBK cells to isolate the IBRV; the TCID 50 of IBRV was determined and it was identified with IBRV FA. The results showed the cytopathic effect （CPE） generated in MDBK. The specific bands could be amplified by PCR with IBRV primers. The sequencing results showed that the sequence was coincided with the published IBRV sequence. The virus titration of the strain was 106.75 TCID 50/mL.

KeywordsOvary; IBRV; Identification; Cytopathic effect （CPE）; TCID 50

牛传染性鼻气管炎病毒 （infectious bovine rhinotracheitis virus， IBRV） 又称牛疱疹病毒Ⅰ型 （bovine herpesvirus  BHV-1），是疱疹病毒科（Herpesviridae）α疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae）水痘病毒属 （Varicellovirus）的成员。牛传染性鼻气管炎（IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病，以高热、呼吸困难、流鼻汁、上呼吸道及气管、黏膜发炎等为特征，还可造成生殖道感染、结膜炎、脑膜脑炎、流产和死胎、乳房炎等多种临床症状[1]。世界动物卫生组织（OIE）将该病列为B类疾病，也是我国进境动物必检疾病之一。IBRV广泛分布于世界各地，每年给各国造成高达30亿～60亿美元经济损失，严重制约了养牛业的持续健康发展[2]。

20世纪50年代首次在北美发现牛传染性鼻气管炎，70年代我国在进口的种牛中发现该病[3]，迄今已成为全球性重要疾病。国外疫苗接种后IBRV 抗体阳性率达24.00%～66.67%[4， 5];罗玉江、冯蒙等分别报道了我国不同省市IBRV 的流行情况，阳性率为41.6%～54.1%[6-9];本研究团队对山东省部分奶牛场进行血清学调查，发现平均感染率为26.67%，但是奶牛卵巢中IBRV的感染率为57.00%，是病毒性卵巢炎的主要病原，给牧场造成严重的经济损失。IBRV可以在原代细胞或牛肾、肺、睾丸、鼻甲或气管等组织细胞及已建立的细胞系如牛肾细胞（MDBK）中分離获得。样品多为鼻腔拭子、咽拭子、阴道拭子、包皮清洗液、流产胎儿的胎盘、脾、肺、肾等。邓沛霖、孔繁德[10，11]等从牛群的阳性血清中分离到该病毒，目前没有从卵巢中分离到该病毒的报道。本研究从无明显临床症状的奶牛卵巢中分离到一株IBRV 病毒，并经测序等试验进行确定。

1材料与方法

1.1样品来源

奶牛卵巢来自山东省定点奶牛屠宰场。

1.2主要试剂与仪器

病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，2×Easy Taq PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司，IBRV FA 荧光抗体购自青岛瑞尔生物技术有限公司，MDBK细胞为山东省农业科学院奶牛研究中心疾病研究室保存。

1.3引物的设计与合成

参考GenBank中牛传染性鼻气管炎病毒的全基因组核酸序列，设计扩增牛传染性鼻气管炎病毒的通用引物，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，引物序列如表1。

1.4样品的处理

取奶牛一对卵巢的部分组织进行研磨，反复冻融3次，用PBS稀释相应的样本，5 000 r/min 离心5 min，取上清液加入青霉素 （200 IU/mL） 、链霉素 （100 μg/mL），用0.22 μm滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存。

1.5病毒DNA的提取及PCR鉴定

取200 μL卵巢组织上清液，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书提取IBRV病毒基因组DNA。以提取的IBRV病毒基因组DNA为模板，IBRV-F/R为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系：DNA模板2 μL，Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，去离子水补至25 μL。PCR扩增程序：95℃ 5 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环;72℃ 10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.6IBRV病毒的分离

选择生长旺盛的MDBK单层细胞，倾去生长液，PBS清洗两次，接种处理好的卵巢组织上清液1 mL，37℃吸附1 h，弃去组织液，加入含有2% FBS的DMEM培养基中，在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每12 h观察细胞病变情况，连续观察7 d。将出现病变（CPE）的细胞反复冻融3 次，收集细胞病毒液，用细胞病毒液再接种MDBK细胞;没有出现CPE的细胞进行盲传，盲传到第3代，仍没有出现CPE，视为阴性。

1.7IBRV病毒TCID 50的测定

将分离到的IBRV病毒液做连续10倍的稀释（10-1～10-10），将稀释好的病毒液接种到已长好MDBK单层细胞的96孔微量培养板中，每一稀释度接种3孔，每孔接种100 μL，同时设置正常的细胞作为对照。在37℃、5% CO2培养箱中孵育1 h，加入维持液100 μL，继续在 37℃、5% CO2培养箱中培养。显微镜下观察CPE，连续观察5 d，按Reed-Muench法计算TCID 50。

1.8IBRV FA观察荧光抗体

将观察完CPE的96孔培养板弃去培养液，用PBS洗涤3遍，拍干;室温用5%的多聚甲醛固定10 min，弃去固定液，自然晾干，再用PBS洗涤3遍，拍干;加入50 μL IBRV FITC荧光抗体，37℃孵育30 min。用PBST洗涤，拍干，在荧光显微镜下观察荧光。

2结果与分析

2.1IBRV的PCR 鉴定

用IBRV的特异性引物对卵巢组织上清液进行PCR 扩增，同时设立阳性、阴性对照，扩增目的片段大小为362 bp，PCR产物测序序列经BLAST比对，与IBRV基因序列一致。PCR检测结果显示，114份奶牛卵巢组织IBRV感染率为57%（65/114），部分檢测结果如图1。

2.2IBRV的分离

从114份卵巢组织中选取10份在MDBK细胞上进行分离，其中编号为53号的卵巢组织在细胞上传至第二代出现明显的CPE，细胞圆缩、拉网，聚集成葡萄串样，在单层细胞上形成空洞，48 h内CPE达到80%左右，细胞大部分脱落。收集到的细胞液经IBRV特异性引物扩增，鉴定为阳性。

2.3IBRV的TCID 50

显微镜下观察每个稀释度出现CPE的孔数（表2），同时结合IBRV FA 荧光抗体的数据，按Reed-Muench法计算IBRV的TCID 50，分离到的该株IBRV病毒滴度为106.75 TCID 50/mL。

2.4IBRV FA结果

在荧光显微镜下，10-1～10-5稀释度均能观察到荧光，10-6稀释度只有一个孔能看见荧光，细胞呈现脱落、拉网的状态（图2），稀释度越大荧光数目越少。

3讨论与结论

牛传染性鼻气管炎是由IBRV引起的一种牛急性接触性传染病，可通过气溶胶、病牛的直接接触等方式传播，但主要是飞沫经呼吸道传播，可形成潜伏感染和持续性感染，对牛生殖道和生殖器官有严重影响，包括流产和呼吸道疾病。病牛和带毒动物是主要传染源，隐性传染的种公牛因精液带毒，是最危险的传染源。病愈牛可带毒半年到一年，甚至更长，随着我国规模化养牛业的发展，牛传染性鼻气管炎的威胁也与日俱增。

IBRV病毒能通过血液到达生殖道，影响生殖器官，卵巢是主要的靶器官。 1985年Van der Maaten等[12]研究发现，从未感染IBRV的奶牛配种后接种IBRV，对其卵巢产生多种影响。目前分离鉴定到的IBRV毒株多数是从鼻拭子、血液中分离到，还没有从卵巢中分离到IBRV的报道。

本研究利用MDBK细胞，首次从奶牛卵巢中分离出1株IBRV，测序后显示与IBRV基因序列一致;该病毒在MDBK细胞上盲传后能明显观察到CPE，用IBRV荧光抗体感染可以看到免疫荧光，说明该分离株为牛传染性鼻气管炎病毒。该研究结果为今后开展IBRV流行病学调查、筛选和选育疫苗候选毒株及诊断方法的研究提供了有价值的毒株，同时为该病的防控提供理论支撑。

参考文献：

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