达托霉素发酵工艺条件响应面优化研究
2019-04-04刘欣周宋汇孙科
刘欣，周宋汇﹡，孙科
(1 江苏省肿瘤医院,江苏省肿瘤防治研究所，南京医科大学附属肿瘤医院， 南京 210009；2 徐州生物职业技术学院 生物工程系，徐州 221006)
达托霉素(doxymycin)是一种环状脂肽类抗生素，可以由玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)发酵得到.达托霉素对绝大多数G+菌具有杀灭的功能，更主要的是它可以作用于耐药菌如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐万古霉素金葡菌(VRSA)等[1,2],近年来成为医药界的研究热点.
达托霉素结构复杂，化学合成难度较大，通常采用生物发酵方法进行生产. 但是发酵法产量较低，一直限制其在我国的规模使用. 目前国内提高达托霉素发酵效价的研究多集中在对优良菌种的选育上，如采用联合抗性筛选法、紫外诱变方法、氦氖激光辐照-亚甲基胍复合诱变法来筛选优良菌种[3-5]. 最新的文献显示，周剑等[6]通过流加补料发酵方式最终使达托霉素产量达到380 mg/L. 本研究以本实验室筛选的诱变玫瑰孢链霉菌FN2015为发酵菌种，优化各项发酵条件，为大规模发酵生产达托霉素提供可供借鉴的理论基础.
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus) FN2015，实验室保藏菌种.
玉米浆试剂级；酵母浸膏、琼脂粉、葡萄糖、氯化钠、七水硫酸镁、三水磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、糊精等为国产分析纯试剂；消泡剂食品级.
1.2 培养基
斜面培养基：葡萄糖2.0%，酵母浸膏1.0%，氯化钠0.05%，七水硫酸镁0.1%，三水磷酸氢二钾0.05%，七水硫酸亚铁0.001%，琼脂粉1.8%.
种子培养基：糊精2.5%，玉米浆0.5%，七水硫酸镁0.1%，三水磷酸氢二钾0.04%.
发酵培养基：玉米淀粉水解糖3.5%，玉米浆0.5%，氯化钾0.05%，消泡剂0.01%.
1.3 仪器与设备
SHP-400智能生化培养箱(苏州威尔)；无菌超净工作台(JB-CJ-1500FX，苏州佳宝) ；多振幅轨道恒温摇床(ZWY-103B ，上海圣科)；机械搅拌式发酵罐(20 L，镇江东方)；台式高速冷冻离心机(H1650R，上海齐闵)；高效液相色谱仪(1260型，美国安捷伦).
1.4 方法
1.4.1 玫瑰孢链霉菌FN2015的培养
取出保藏在超低温冰箱中的FN2015的孢子，接种到斜面培养基上，30 ℃、35%～55%的湿度下培养10～12 d，制备孢子悬液浓度为107个/mL. 取1 mL孢子悬液接种到装100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，于恒温摇床中培养，培养条件为：28 ℃、200 r/min. 培养42 h后按9%的接种量接种到5 L小型发酵罐，发酵条件为：温度(28±1) ℃、搅拌转速240～300 r/min、空气流量6～7 L/min、罐压0.05 MPa.
1.4.2 发酵条件确定方法
选取对达托霉素发酵影响显著的5个因素温度、初始pH值、接种量、通风量和搅拌转速进行单因素实验. 以某个发酵条件为变量，其他条件固定不变，通过实验确定此发酵条件.
1.4.3 发酵条件优化方法
以单因素实验的5个因素作为影响因子进行响应面实验，通过Box-Behnken试验水平设计[7]，具体的实验设计如表1，其中温度为影响因子A、初始pH值为影响因子B、接种量为影响因子C、通风量为影响因子D、搅拌转速为影响因子E.
表1 Box-Behnken实验因子水平设计Tab.1 Level design of Box-Behnken test factor
1.4.4 达托霉素效价测定方法
达托霉素的效价测定见文献[8].
2 结果与分析
2.1 单因素实验及结果
2.1.1 发酵温度对达托霉素发酵结果的影响
其他条件不变，选取不同发酵温度24、26、28、30和32 ℃，测定达托霉素的产量，从图1 可以看出当发酵温度为28 ℃时，达托霉素的产量最高为880.18 mg/L，因此达托霉素发酵的最适温度为28 ℃.
图1 发酵温度对达托霉素发酵的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on doxymycin fermentation
2.1.2 初始pH值对达托霉素发酵结果的影响
在不同的发酵初始pH值条件下，当发酵初始pH值为8.0时(图2)，达托霉素的产量最高为879.83 mg/L，所以选定达托霉素发酵初始pH值为8.0.
图2 初始pH值对达托霉素发酵的影响Fig.2 Effect of initial pH value on the fermentation of doxymycin
2.1.3 接种量对达托霉素发酵结果的影响
选择不同的接种量 4%、6%、8%、10%和12%进行发酵，然后测定达托霉素的产量，从图3 可以看出当接种量为10%时，达托霉素的产量最高为881.52 mg/L，所以达托霉素发酵的最适接种量为10%.
图3 接种量对达托霉素发酵影响Fig.3 Effect of inoculation volume on the fermentation of doxymycin
2.1.4 通风量对达托霉素发酵结果的影响
选取不同的通风量 3.0、4.0、5.0、6.0和7.0 L/min，测定达托霉素的产量，当通风量为6.0 L/min时(图4)，达托霉素的产量最高为883.57 mg/L，因此达托霉素发酵最适的通风量设为为1.2 L/min.
2.1.5 搅拌转速对达托霉素发酵结果的影响
其他条件不变，分别选取不同的搅拌转速 150、200、250、300和350 r/min，测定达托霉素的产量，从图5 可以看出当搅拌转速为250 r/min时，达托霉素的产量最高，为882.69 mg/L，因此选择250 r/min作为发酵搅拌速度.
图4 通风量对达托霉素发酵影响Fig.4 Effect of ventilation on doxymycin fermentation
图5 搅拌转速对达托霉素发酵影响Fig.5 Effect of stirring speed on the fermentation of doxymycin
2.2 发酵条件的响应面优化
2.2.1 回归模型建立
以达托霉素产量为因变量Y，温度A、初始pH值B、接种量C、通风量D和搅拌转速E为自变量,利用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行回归分析,建立多元回归模型[9-11]：
Y=100.00+5.94A+16.58B+15.64C+8.37D+
10.31E+10.75AB+4.69AC-3.38AD-5.47AE-
8.05BC+14.38BD-3.06BE+0.93CD+7.27CE-
12.52DE-17.49A2-13.51B2-
18.94C2-27.28D2-15.27E2.
以单因素结果为依据设计Box-Behnken试验的因素水平，响应面的实验结果见表2.
表2 Box-Behnken试验结果Tab.2 Results of the Box-Behnken test
2.2.2 达托霉素产量的方差分析
对回归方程进行方差分析，分析结果见表3.
表3 达托霉素产量回归模型方差分析Tab.3 Variance analysis of the yield regression model of doxymycin
从表3可以看出：模型的F值为13.33，Pr>F小于0.0001，表明自变量(A、B、C、D、E)和因变量Y之间线性关系极显著，所建立的回归方程可以对真实曲面模拟；相关系数R2=0.9643表明模型拟合程度高，置信度高[7]，可以利用建立的模型分析达托霉素产量的变化.
利用Design Expert 8.0.6软件对回归方程进行一阶偏导求解[12,13]，曲面最大点对应A=0.42、B=1.35、C=0.32、D=0.45、E=0.21，所对应的达托霉素发酵的条件分别为：温度 27.74 ℃、pH值8.36、接种量8.48%、通风量6.13 L/min、搅拌转速242 r/min.
2.2.3 达托霉素发酵条件实验验证
为了验证响应面结果的可靠性，采用响应面实验条件(温度 27.74 ℃、pH值 8.36、接种量 8.48%、通风量 6.13 L/min、搅拌转速 242 r/min)进行小型发酵罐发酵实验，4个平行，结果显示，达托霉素的产量达到880.48 mg/L.
3 结语
达托霉素是一种新型抗生素，主要通过发酵法进行生产，但发酵产量一直不高限制了达托霉素的大规模使用. 本研究在单因素实验的基础上，采用响应面法对达托霉素发酵工艺条件进行优化，优化后发酵工艺条件为温度 27.74 ℃、pH值 8.36、接种量 8.48%、通风量 6.13 L/min、搅拌转速242 r/min，在此条件下达托霉素的效价可达880.48 mg/L，比最新文献[14-17]报导的结果高出50%～132%，发酵效价大幅度提高，此次研究对工业化发酵生产达托霉素具有重要的参考价值. 要进一步提高发酵的效价，在发酵过程中最好筛选出合适的前体，采用流加方式发酵，这将是本研究下一步的工作.
