枝状枝孢霉MD2的候选基因A00981的克隆及转基因菌株的构建

张鹏，刘盼，周兰，裴婷，甘喆，李浩东，宋发军

(中南民族大学 生命科学学院 生物技术国家民委重点实验室/武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074)

内生真菌是抗癌药物紫杉醇的重要药源途径之一[1].自1993年首次报道发现产紫杉醇内生真菌-Taxomyceandreanae[2]后，已有几百株产紫杉醇内生真菌被报道[3].Somjaipeng S等[4]从温带红豆杉中分离筛选出两株内生真菌Paraconiothyriumvariabile和黑附球菌(Epicoccumnigrum)，紫杉醇产量分别为1.75,1.32 μgL-1.Sah B等[5]从胡椒中分离出一株产紫杉醇内生真菌龙眼焦腐病菌(Lasiodiplodiatheobromae)，紫杉醇产量为247 μgL-1. El-Sayed等[6]分别从罗汉松的纤毛木和枝条中分离到3株产紫杉醇内生真菌，土曲霉EFB108, EFB59, EFB14，其中EFB108紫杉醇产量较高为265 μgL-1.但目前关于内生真菌的紫杉醇合成途径尚不清楚，其紫杉醇合成相关基因的报道极少[7]，严重限制了内生真菌紫杉醇合成的分子机理研究及高产工程菌株的创建.

枝状枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides，简称枝霉) MD2是本课题组前期分离的产紫杉醇内生真菌，在完成其转录组分析[8]的基础上，本文克隆了枝霉MD2的紫杉醇合成相关候选基因A00981，采用生物信息学技术预测其结构和功能，构建了该基因的超表达载体并转化枝霉MD2，通过抗性筛选和分子鉴定，共获得9株转基因菌株，其中5株转基因菌株的外源基因是以单拷贝方式插入，为深入研究候选基因A00981的功能奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枝霉MD2和根癌农杆菌AGL-1为本实验室保存.T4 DNA连接酶、SpeI、Hind Ⅲ限制性内切酶(TAKARA)；RNA提取试剂盒(TIANGEN)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(TOYOBO)；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit(Roche)；引物合成及测序(武汉擎科生物科技).

高速冷冻离心机(FRESCO 21，Thermo)；PCR仪(C1000 Touch，Bio-Rad)；生化培养箱(SPX智能型，宁波江南仪器厂)；分子杂交仪(QF-1，上海乔枫实业).

1.2 候选基因A00981 的克隆与生物信息学分析

参考课题前期报道[9]提取枝霉MD2的基因组DNA和总RNA，并将RNA反转录成第一链cDNA.采用引物A00981-F：5′-ATGGCCGGAATGGCAATC-3′和A00981-R：5′-CTACAATCTCGCCTTGGG-3′分别扩增候选基因的DNA和cDNA序列.扩增条件为：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性15 s, 55 ℃复性15 s, 72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃延伸5 min.扩增产物经测序验证后，参照前期报道[10]，采用Vector NTI 比对A00981的DNA序列与cDNA序列，分析其是否有内含子.采用Blastp, ProtParam, ProtScale, TMHMM, SignalP 4.1, NCBI中CDD, SMART, SWISS-MODEL等软件进行候选基因的生物信息学分析.

1.3 过表达载体pTFC-A00981 的构建与转化

先采用Overlapping方法将PtrpC启动子、候选基因A00981和TtrpC终止子依次连接构建其表达框，再将其表达框于SpeI位点插入pTFC质粒构建候选基因的过表达载体pTFC-A00981.采用热激法将pTFC-A00981转入根癌农杆菌AGL-1，并参照本实验室前期建立的转化体系转化枝霉MD2[11].最后，通过潮霉素(30 mgL-1)抗性筛选及连续2次继代培养，获得转基因菌株.

表1 A00981基因表达框构建所需引物Tab.1 Primer sequences for construction of A00981 gene expression cassette

注：下划线为限制性酶切位点

1.4 转基因菌株的检测

分别提取转基因菌株和对照(未转基因)菌株的基因组DNA为模板，采用引物hptII-F： 5′-ATGAAAAAGCCTGAACTCAC-3′和hptII-R：5′-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3′检测潮霉素基因(hygromycin resistance gene,hptII)的转化情况；并用Hind Ⅲ完全酶切各个转基因菌株和对照菌株(阴性对照)的基因组DNA，并以pTFC-A00981质粒作阳性对照，采用Southern blot分析转基因菌株的外源基因的转化情况.

2 结果与分析

2.1 候选基因A00981 的克隆与分析

候选基因A00981的cDNA序列为894 bp，DNA序列为969 bp，含有1个75 bp的内含子.Blast P比对结果表明，候选基因A00981的编码蛋白与柑橘澳洲痂囊腔菌(Elsinoeaustralis)的酰基辅酶A脱氢酶(acyl-CoA dehydrogenase，ACAD,GenBank No.PSK41880.1)有73%的一致性；与Sphacelomamurrayae的ACAD (GenBank No.PNS15105.1) 和ExophialadermatitidisNIH/UT8656 的ACAD (XP_009152775.1)有72%的一致性；与AureobasidiumnamibiaeCBS 147.97的ACAD (XP_013430645.1)有71%的一致性(见图1).

图1 候选基因A00981的系统进化分析Fig.1 phylogenetic analysis of candidate gene A00981

ProtParam预测结果表明该基因编码蛋白包含298个氨基酸，相对分子量为32823.12Da，等电点(pI)为9.14，分子式为C1458H2331N401O421S19.ProtScale,TMHMM和SignalP4.1预测结果表明，该基因编码蛋白为亲水蛋白(图2A)、无跨膜结构域(图2B)和信号肽(图2C).经NCBI中CDD,SMART,SWISS-MODEL预测结果表明：A00981编码蛋白保守结构域被注释为酰基辅酶A脱氢酶(图2D)，在C端和N端各有1个ACDA催化结构域(图2E)，三级结构与嗜碱土芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)ACDA晶体结构同源性为28.04%，并利用同源建模法预测了该蛋白的三级结构(图2F).

A)亲疏水性; B) 跨膜结构域; C) 信号肽; D) 保守结构域; E) 二级结构域; F) 三级结构图2 候选基因A00981的生物信息学预测Fig.2 Bioinformatics analysis of candidate gene A00981

2.2 pTFC-A00981 载体的构建与转化

采用overlapping方法构建约1865 bp的表达框(PtrpC-A00981-TtrpC)，并插入pTFC质粒的多克隆位点构建候选基因的过表达载体pTFC-A00981，经SpeI酶切验证正确(图3A)后，转化枝霉MD2.将转基因菌株通过抗性筛选及连续两次继代(5 d/代)后，与未转基因(对照)菌株分别接种于含有潮霉素的抗性平板培养5 d，结果表明，对照菌株不能正常生长，而转基因菌株在抗性平板上长势良好(图3B).本研究共获得9株转基因菌株.

M) DL2000; 1) 质粒酶切; A) pTFC-A00981的酶切分析; B) 转基因菌株(左)和对照菌株(右)的抗性验证图3 pTFC-A00981载体的构建及转基因菌株的抗性验证Fig.3 Construction of pTFC-A00981 and resistance verification of A00981-transgenic strains

2.3 转基因菌株的检测

抗性基因hptII的扩增结果(图4A)表明，9株A00981-转基因菌株均可扩增到hptII基因，而对照菌株无扩增产物，初步说明含有抗性基因hptII的T-DNA片段与宿主染色体整合.Southern blot检测结果进一步表明，9株转基因菌株的外源基因均成功与宿主染色体整合；其中5株转基因菌株的外源基因是以单拷贝方式整合，对照菌株含有1个拷贝的候选基因A00981(图4B).

M1) DL2000; M2) DL λ-DNA/Hind Ⅲ; 1) 对照菌株; 2) pTFC-A00981; 3～11) A00981/MD2转基因菌株 A)hpt II基因的扩增; B) 转基因菌株的Southern blot分析图4 A00981/MD2转基因菌株的分子验证Fig.4 Molecular identification of A00981/MD2 transgenic strains

3 讨论

本研究首次从产紫杉醇内生真菌枝霉MD2中克隆了候选基因A00981，生物信息学预测结果表明该基因编码蛋白在C端和N端均具有ACAD催化结构域，与柑橘澳洲痂囊腔菌(E.australis)的ACAD具有73%的一致性，因此，候选基因A00981的功能可能是通过编码ACAD酶，调节脂肪酸β氧化，为宿主紫杉醇合成的MVA途径提供乙酰辅酶A，调节真菌枝霉MD2紫杉醇合成.在此基础之上，本研究构建了候选基因A00981的过表达载体并转化枝霉MD2，共获得9株转基因菌株，其中5株转基因菌株的外源基因是以单拷贝方式插入.这些转基因菌株的获得为后期深入分析候选基因A00981对宿主紫杉烷类合成的作用奠定了基础.