早期使用羟氯喹对系统性红斑狼疮模型鼠内皮功能障碍的影响

孙 乾

0 引言

近年来，系统性红斑狼疮(SLE)患者的存活率显着升高。预后改善的原因包括早期诊断，增强对轻度形式的识别，以及谨慎使用诸如糖皮质激素和免疫抑制剂的治疗。然而，由于预期寿命延长，SLE患者暴露于与疾病活动后遗症药物不良反应和共病症状[如心血管疾病(CV)早发率]相关的发病风险增加[1-2]。加速动脉粥样硬化是SLE患者CV发病和死亡的主要原因之一。近30年来，除心血管疾病外，SLE患者所有原因的死亡率都显著降低。由于上述原因，预防SLE患者长期CV并发症仍然是一个尚未解决的问题。除了伴随传统的CV风险因素，包括肥胖、高血压、血脂异常和糖尿病，SLE本身对血管系统会产生直接有害的影响，这使得SLE本身成为一种有效的独立CV风险因子[3-4]。内皮功能障碍(ED)的特征在于一氧化氮(NO)的可用性受损以及伴随的活性氧(ROS)生成增加[5]。这种全身性疾病是大多数心血管危险因素所共有的，是动脉粥样硬化和血栓形成的早期和主要促进因子，并且与CV事件独立相关[5]。SLE和动脉粥样硬化共享血管炎症，ROS过量、免疫复合物和补体激活等机制都能引发ED。羟氯喹(HCQ)是一种具有免疫调节特性的抗疟疾化合物，由于其多种有益作用，包括控制疾病活动、减少损伤、提高生存率和相对安全的特征，广泛用于SLE[6-10]。近年研究显示，HCQ治疗与SLE中CV预后的改善有关。SLE对传统CV风险因素和血栓形成风险有促进作用;此外，其还对血管反应性指数有益[11-12]。然而，目前尚不清楚抗疟药的保护性CV效应是否是更好地控制疾病活动的间接结果，或者是HCQ对内皮微环境的直接影响。狼疮鼠模型的可用性提供了良好的条件，可以在“简化”环境中研究这种关系，以提高对多种因素作用的理解。Gómez-Guzmán等[13]研究表明，在疾病晚期开始的HCQ短期治疗能够在小鼠SLE模型的大动脉水平上逆转ED。除了抗疟疾在成熟疾病条件下的有益作用外，早期HCQ的使用也与人类SLE发作延迟有关。我们假设在完全疾病发作之前用HCQ治疗可能会延迟甚至预防SLE相关的ED。本研究旨在评估HCQ对SLE小鼠模型内皮功能的影响及其潜在机制。

1 资料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物 普通级健康雌性大鼠120只，体重(148±20)g,由辽宁中医药大学动物实验中心提供。

1.1.2 实验药品及制备 羟氯喹片(上海中西制药有限公司，批号：170406)。

1.1.3 主要试剂 降植烷试剂：购自上海如吉生物科技发展有限公司,批号：049k8700；免疫吸附测定试剂盒：美国德克萨斯州圣安东尼奥公司。乙酰胆碱浓度测定试剂盒：美国Sigma-Aldrich公司。NAD(P)H氧化酶抑制剂,APO(瑞士圣加伦大学)。

1.1.4 主要仪器及设备 电子天平：瑞士preci-sa，型号：xs-225A；低速台式离心机：北京医用离心机厂，型号：LD4-ZA；Axio Imager Z1显微镜(Carl Zeiss MicroImaging,Jena,德国)；加压肌动图(110P型，丹麦)。以上均由辽宁中医药大学分子生物实验室提供。

1.1.5 实验室 整个实验室均安排在辽宁中医药大学清洁级实验室中实施。本课题涉及实验室-分子生物学实验室系国家中医药管理局局级科研三级实验室(2002年批准)。

1.2 实验方法与结果

1.2.1 实验动物分组 选择雌性健康大鼠120只，体重(148±20)g，鼠龄4周。随机选大鼠40只为对照组，另外80只建立降植烷诱导的SLE模型。后者随机分为模型组和羟氯喹组，40只为一组。

1.2.2 模型制备 随机取40只为对照组，另外80只建立降植烷诱导的SLE模型。一次性腹腔注射降植烷0.5 ml。

1.2.3 处理因素 ①模型组:造模后4周开始给予生理盐水[2 ml/(只·d)]灌胃。②羟氯喹组:随机分配到饮用水中接受HCQ[3 mg/(kg·d)]治疗。③对照组:不做任何处理。

1.2.4 取材 以上各组雌性鼠在周龄为12、18、24、30周时，随机取10只在阿维汀诱导的麻醉下死亡。血清和尿化验:在小鼠被杀时采集血样并立即放入肝素管中。在杀死小鼠时，收集血样并立即置于肝素化管中。通过离心分离血清并储存在-70 ℃。小肠系膜动脉的制备:将肠系膜动脉树的一个二阶分支解剖并安装在加压肌电图上，在45 mmHg内压力下测量介质和腔的尺寸。

1.2.5 指标检测 血清和尿化验:用酶联免疫吸附测定试剂盒分析抗dsDNA自身抗体的血清滴度，在代谢笼中收集24 h尿蛋白排泄物，并通过试纸分析测量。小肠系膜动脉功能试验：血管内皮依赖性舒张因子(NO)的评估是通过测量肠系膜动脉乙酰胆碱缓慢的反应累积浓度来进行。该浓度在剂量滴定实验中确定，建立阈值浓度，可引起实验组间类似的收缩。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件，数据比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 24 h尿蛋白含量测定 模型组24 h尿蛋白含量明显增多(P<0.05)。24周及30周羟氯喹组较模型组24 h尿蛋白定量明显下降(P<0.01)，与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠24 h尿蛋白含量比较(mg)

2.2 酶联免疫吸附测定试剂盒分析抗dsDNA自身抗体的血清滴度 降植烷造模4周后，对周龄12、18、24、30周的模型组、羟氯喹组、对照组大鼠dsDNA自身抗体的血清滴度(酶联免疫吸附法测定)进行比较，结果使用微量滴定板读数器测量的光密度(OD)(血清在450 nm处的OD读数的平均值)表示，24周时模型组dsDNA血清滴度明显高于羟氯喹组(P=0.02)。见图1。

2.3 NO可用性评估 通过测量肠系膜动脉乙酰胆碱(ACh)缓慢的反应累积浓度间接测量NO的可用性。对照组响应于ACh的放松保持到24周，但是在30周减弱。模型组ACh响应松弛，在基线时保留，但在18、24、30周时显著低于对照组(P<0.05或P<0.01)。羟氯喹组18、24周时ACh响应的松弛正常化。30周时，HCQ对于动物的内皮功能的调节无效(P>0.05)。见图2。

图1 各组大鼠dsDNA自身抗体血清滴度比较

图2 各组大鼠肠系膜动脉NO可用性评估

3 讨论

本研究结果表明，HCQ早期施用能够在SLE的小鼠模型中阻止ED的发展。先前已在小鼠以及人SLE中描述了内皮功能损伤[14]。本研究的小鼠模型中，ED在疾病的非常早期阶段。在18周龄时，模型组肠系膜小动脉已显示出内皮依赖性舒张减弱，并且在此阶段抗dsDNA抗体呈阳性。为了排除这些影响可能是由衰老本身引起的(这是一个公认的血管功能改变的主要原因)，每次疾病测量结果都与年龄相关的对照组进行比较，在30周龄时，对照组NO的可用性降低，但模型组降低更明显。表明无论疾病活动和衰老情况如何，SLE相关ED均是在疾病过程早期发生的功能性血管改变，完全支持SLE患者的观察结果。这些患者可能经历过早期动脉粥样硬化,而与CV疾病的传统危险因素无关。

众所周知，肾脏受累本身可引起ED。因此，观察到HCQ对内皮功能的有益作用可能是肾病改善的结果。然而，在我们的实验模型中，考虑到HCQ诱导的ED逆转发生在明显的肾脏疾病之前，该假设不太可能成立。此外，即使长期施用HCQ对蛋白尿和抗dsDNA自身抗体具有积极作用，其保护性血管作用也不仅与肾脏疾病有关，还与药物干扰血管炎症过程的能力以及导致ED的免疫机制有关[15-17]。

有研究表明，同一模型中，36周龄时主动脉的内皮依赖性血管舒张受损明显，与疾病的表现一致。而本研究结果表明，在完全疾病表达之前也显示出早期血管内皮细胞的功能受损。Gómez-Guzmán等[13]在相同的SLE模型中，描述了短期HCQ对血管参数(高血压、心率、心脏肥大以及与疾病相关的变量)的保护作用。与本研究类似，该研究发现，即使在诸如主动脉的大血管床中，HCQ对血管内皮依赖性血管舒张仍有有益作用。

综上所述，早期HCQ治疗能够减少SLE鼠模型中与炎症过程相关的早期ED。这些数据可能支持临床观察HCQ在预防人类SLE血管损伤方面的潜在有益作用,并可能支持早期疾病发作患者早期引入HCQ。