蛇葡萄素通过Dermcidin蛋白调节肝癌细胞株HepG2侵袭活力及侵袭基因表达的实验

李关宁，杨振淮，耿燚

0 引言

肝癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤，肿瘤病灶的血供丰富、癌细胞的增殖和侵袭活力旺盛，确诊时多已发展至中晚期、预后较差。目前，临床上用于肝癌治疗的手段包括手术切除、放化疗、热疗、射频消融、靶向药物等，但疗效并不理想[1-2]。因此，探寻肝癌治疗的新药具有迫切的临床价值。近年来，中药材的抗肿瘤价值受到了越来越多的关注。蛇葡萄素（ampelopsin,AMP）是从粤蛇葡萄及显齿蛇葡萄中提取得到的黄酮类化合物，已经在多种恶性肿瘤中被证实具有抗癌活性[3]。Dermcidin蛋白是新发现的与肝癌病理进程密切相关的一种蛋白，由dermcidin基因编码并且在肝癌组织中呈高表达的趋势[4]。本研究拟通过离体培养的肝癌细胞株HepG2来验证AMP对细胞侵袭活力及侵袭基因表达的调节作用，进一步通过转染小干扰RNA（siRNA）的方式来敲低dermcidin基因的表达并明确AMP在肝癌细胞内的生物学效应是否由dermcidin基因介导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

肝癌细胞株HepG2购于美国ATCC细胞公司，细胞培养基RPMI 1640及胎牛血清购于美国Gibco公司，AMP购于成都曼斯特公司，Transwell小室购于美国Millipore公司，Matrigel基质胶购于美国BD公司，LipofectamineTM2000转染试剂购于美国Invitrogen公司，dermcidin基因的siRNA及阴性对照（NC）siRNA购于上海吉玛公司，荧光定量PCR检测所用引物购于上海生工公司、试剂盒购于北京天根公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 肝癌细胞株HepG2用含有10%胎牛血清的RPMI 1640在培养瓶内进行培养，培养条件为100%饱和湿度、5%CO2、37℃，细胞密度生长至90%后用胰蛋白酶进行消化，消化后的细胞继续传代并用于后续实验。

1.2.2 细胞处理 细胞接种在培养板内，待细胞密度生长至80%～90%后进行处理，对照组处理条件为不含血清及药物的RPMI 1640，AMP组处理条件为含有不同剂量AMP的无血清RPMI 1640（AMP终浓度为20、40、60、80 μmol/L）；siRNA转染采用LipofectamineTM2000转染试剂，在含有80 μmol/L AMP的无血清RPMI 1640中转染dermcidin基因的siRNA。

1.2.3 细胞迁移及侵袭的Transwell检测 将细胞接种在预先涂有Matrigel基质胶的Transwell小室及未涂Matrigel基质胶的Transwell小室，不同条件处理后24 h用棉签擦拭Transwell小室内膜的细胞，结晶紫染色15 min后在40倍的高倍视野下随机观察4个视野，计数后计算平均数。

1.2.4 基因mRNA表达量的检测 将细胞接种在12孔细胞板内，不同条件处理后24 h弃去培养液，保留细胞并用PBS缓冲液清洗2遍。采用试剂盒抽提细胞内的RNA并反转录为cDNA，按照cDNA 2 μl、含酶的PCR反应混合液10 μl、5 μmol/L的引物混合液0.8 μl、去离子水7.2 μl的方案配置反应体系，按照95℃ 20 s、基因特异性退火温度15 s、72℃ 25 s的反应程序重复40次，在软件中生成反应曲线后读取循环阈值（cycle threshold, Ct），根据2-ΔΔCt计算基因的mRNA表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0软件录入数据，计量资料的两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AMP对HepG2细胞迁移和侵袭的调节作用

在不含Matrigel基质胶的Transwell小室内，不同剂量AMP处理后细胞的迁移数目均低于对照组，且AMP剂量越大、细胞的迁移数目越少，20、40、60、80 μmol/L AMP组与对照组相比，P值依次为0.002、9.777×10-5、9.678×10-6、2.401×10-6，差异有统计学意义，见图1；在含有Matrigel基质胶的Transwell小室内，不同剂量AMP处理后细胞的侵袭数目均低于对照组且AMP剂量越大、细胞的侵袭数目越少，20、40、60、80 μmol/L AMP组与对照组相比，P值依次为0.002、2.390×10-5、2.585×10-6、6.013×10-7，差异有统计学意义，见图2。

图1 AMP处理后HepG2细胞在不含Matrigel基质胶的Transwell小室内的迁移数目Figure 1 Number of migration HepG2 cells treated with AMP in Transwell chamber without Matrigel

图2 AMP处理后HepG2细胞在含有Matrigel基质胶的Transwell小室内的侵袭数目Figure2 Number of invadsion HepG2 cells treated with AMP in Transwell chamber without Matrigel

2.2 AMP对HepG2细胞中Dermcidin mRNA水平的调节作用

对照组中Dermcidin mRNA水平为（1.09±0.17），20、40、60和80 μmol/L剂量AMP处理后细胞中Dermcidin mRNA水平分别为（0.85±0.12）、（0.67±0.07）、（0.51±0.07）和（0.39±0.05）。不同剂量AMP处理后，细胞中Dermcidin mRNA水平均降低，且AMP剂量越大、细胞Dermcidin mRNA水平越低，20、40、60、80 μmol/L AMP组与对照组相比，P值依次为0.018、0.0002、1.583×10-5、2.147×10-6，差异有统计学意义，见图3。

图3 AMP处理后HepG2细胞中Dermcidin mRNA的表达水平Figure3 Expression of Dermcidin mRNA in HepG2 cells treated with AMP

2.3 AMP对HepG2细胞中侵袭基因mRNA表达水平的调节作用

不同剂量AMP处理后，细胞中MMP2、MMP9和MMP10 mRNA水平均降低，且AMP剂量越大，细胞中MMP2、MMP9和MMP10 mRNA水平越低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 AMP处理后HepG2细胞中侵袭基因mRNA的表达水平Table1 Expression of invasion gene mRNA in HepG2 cells treated with AMP

2.4 AMP联合Dermcidin siRNA对HepG2细胞迁移和侵袭数目、侵袭基因mRNA表达水平的调节作用

在含有80 μmol/L AMP的RPMI 1640中转染dermcidin基因的siRNA，与80 μmol/L AMP处理组比较，细胞的迁移、侵袭数目以及细胞内MMP2、MMP9和MMP10 mRNA的表达水平均增多，见图4～5、表2。

图4 AMP联合dermcidin siRNA后HepG2细胞的迁移数目Figure4 Number of migration HepG2 cells treated with AMP combined with dermcidin gene siRNA transfection

图5 AMP联合dermcidin siRNA后HepG2细胞的侵袭数目Figure5 Number of invasion HepG2 cells treated with AMP combined with dermcidin gene siRNA transfection

表2 AMP处理转染dermcidin基因的siRNA后HepG2细胞中侵袭基因mRNA的表达水平Table2 Expression of invasion gene mRNA in HepG2 cells treated with AMP combined with dermcidin gene siRNA transfection

3 讨论

肝癌具有恶性程度高、容易发生远处转移，5年生存率较低、预后较差的特点，病灶内癌细胞侵袭活力的过度增强是与肝癌预后密切相关的病理环节，抑制肝癌细胞的侵袭活力被认为是治疗疾病的潜在靶点[5-6]。AMP是从粤蛇葡萄及显齿蛇葡萄中提取的抗癌活性物质，在乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中被证实具有确切的抗癌活性[7-8]。本研究在Transwell小室内培养肝癌细胞并用AMP进行处理，肝癌细胞在预先涂有Matrigel基质胶的Transwell小室及未涂Matrigel基质胶的Transwell小室内的移动分别能够反应细胞的侵袭和迁移，分析结果显示：AMP能够以剂量依赖性的方式降低肝癌细胞在Transwell小室内的侵袭和迁移数目，AMP剂量越大、肝癌细胞侵袭和迁移受抑制的效应越显著，进而也表明AMP能够有效抑制肝癌细胞的侵袭活力。

肝癌细胞的迁移和侵袭过程依赖多种蛋白酶的水解活性，MMP2、MMP9和MMP10是目前已知与肝癌侵袭密切相关的MMPs成员[9-11]，本研究进一步分析了AMP处理对肝癌细胞中MMP2、MMP9和MMP10表达的影响并发现：AMP能够以剂量依赖性的方式降低肝癌细胞中MMP2、MMP9和MMP10 mRNA表达水平，且AMP剂量越大，肝癌细胞中MMP2、MMP9和MMP10表达受抑制的效应越显著。MMP2、MMP9和MMP10的生物学活性是参与细胞外基质及基底膜中胶原蛋白、层黏连蛋白、弹性蛋白等成分的水解；在生理条件下，细胞外基质及基底膜内含有丰富的蛋白成分，能够使细胞锚定于局部组织、抑制细胞向远处移动；而在本实验中，AMP以剂量依赖性的方式降低MMP2、MMP9和MMP10的表达后，蛋白酶水解细胞外基质的能力减弱，进而使细胞的迁移和侵袭过程受到阻碍。以上MMPs相关的结果表明，AMP能够有效抑制肝癌细胞中多种MMPs的表达，进而使MMP所介导的细胞外基质及基底膜水解效应受阻并降低肝癌细胞的侵袭活力。

在明确AMP能够降低肝癌细胞侵袭活力后，需要进一步明确AMP发生该效应的分子机制。dermcidin基因所编码的Dermcidin蛋白是在肝癌病灶内高表达的蛋白，且参与了肝癌的病理进程[12-13]，我们通过分析AMP处理后细胞内dermcidin基因表达的变化可知：AMP能够以剂量依赖性的方式降低肝癌细胞中Dermcidin的mRNA表达水平且AMP剂量越大，肝癌细胞中Dermcidin表达受抑制的效应越显著。这一结果表明AMP能够降低肝癌细胞中Dermcidin的表达，结合Dermcidin的生物学功能提示AMP能够通过下调Dermcidin的表达来影响肝癌细胞的侵袭活力。为了进一步验证这一推测，我们通过转染siRNA的方式来抑制肝癌细胞中Dermcidin的表达，在AMP处理的同时抑制Dermcidin的表达并观察侵袭活力的变化可知：转染Dermcidin siRNA能够使AMP降低肝癌细胞迁移侵袭能力、侵袭基因表达的效应发生逆转。由此提示AMP抑制肝癌细胞侵袭活力的效应部分由Dermcidin介导，也说明AMP能够通过下调Dermcidin蛋白的表达来降低肝癌细胞的侵袭活力。

以上研究结果表明，AMP对肝癌细胞的侵袭活力以及细胞内侵袭基因的表达具有显著的抑制作用，且抑制Dermcidin蛋白的表达是AMP发挥侵袭抑制活性的分子途径之一。