聚肌胞对活化早期T细胞PD-1表达的诱导及对黑色素瘤生长的抑制作用

陈婷，林万尊，郑伟丽，谢贤和，王自力

0 引言

肿瘤微环境可以通过多种机制导致免疫逃逸，其中程序性死亡受体1（PD-1）介导信号发挥关键作用。PD-1是一种Ⅰ型跨膜蛋白受体，表达于多种免疫细胞（包括活化的T细胞）表面，部分肿瘤细胞高表达PD-1配体PD-L1，PD-1与配体结合后诱导T细胞功能障碍，即T细胞衰竭，衰竭型T细胞无法合成IFN-γ。临床上广泛应用的抗PD-1治疗就是为了挽救衰竭型T细胞[1-3]。Tumeh等[4]指出抗PD-1治疗黑色素瘤有效的前提是治疗前肿瘤组织中存在能被PD-1信号调节的CD8+T细胞。然而，PD-1在T细胞活化后的哪个阶段开始表达并抑制T细胞功能？是否所有表达PD-1的T细胞都是衰竭型T细胞？这些问题仍不明确。因此，本课题聚焦T细胞的活化阶段，研究T细胞活化初期PD-1表达情况。

Poly I:C是合成的双链RNA类似物，为Toll样受体3（TLR3）配体，TLR3广泛分布于多种免疫细胞表面，包括树突状细胞和自然杀伤细胞等。Poly I:C与受体结合后能有效激活非特异性免疫系统并促进T细胞活化[5-6]。我们以黑色素瘤荷瘤小鼠为模型，研究发现Poly I:C可以有效促进T细胞活化；同时，小鼠经OVA肽+Poly I:C免疫后7天，处于活化早期阶段的（仍在脾组织内，还未向靶器官迁移的）特异性CD8+T细胞表达PD-1，这部分细胞仍然具有功能，可以合成T细胞功能性标志IFN-γ。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂、材料与仪器

健康清洁级6～8周龄雌性C57BL/6小鼠购于上海斯莱克公司。B16F10小鼠黑色素瘤细胞购于中科院上海细胞库。鸡卵清蛋白（OVA257-264）抗原肽（OVA肽）：SIINFEKL合成于上海淘普生物技术公司。CD8体内敲除抗体购于美国InvivoMab公司。Poly I:C购于美国InvivoGen公司。FITC标记的抗鼠CD3抗体、APC标记的抗鼠CD3抗体、PE标记的抗鼠IFN-γ抗体、Percp cy5.5标记的抗鼠CD8抗体、APC标记的抗鼠CD4抗体和FITC标记的抗鼠PD-1抗体购于美国eBioscience公司。胞内染色试剂盒和PMA购于美国BD公司。PBS磷酸盐缓冲液（粉剂）购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司；DMEM高糖培养基购于美国Ionomycin公司。Iomomycin购于爱必信公司；仪器：A6流式细胞仪，37℃恒温培养箱。

1.2 方法

1.2.1 小鼠免疫干预

1.2.1.1 Poly I:C对非特异性T细胞活化的影响 将6只体重相近的6～8周龄C57BL/6小鼠随机分成两组：对照组和实验组。对照组小鼠腹腔注射200 μl PBS，实验组每只小鼠腹腔注射50 μg Poly I:C（Poly I:C溶解于总量为200 μl的PBS中）。7天后分别处死各组小鼠，取得脾组织。

1.2.1.2 Poly I:C对特异性CD8+T细胞（OVA257-264）活化的影响 将12只体重相近的6～8周龄C57BL/6小鼠随机分成四组：对照组、OVA肽组、Poly I:C组和OVA肽+Poly I:C组。对照组：小鼠腹腔注射200 μl PBS；OVA肽组：每只小鼠腹腔注射200 μg OVA肽（肽段溶解于总量为200 μl的PBS中）；Poly I:C组：每只小鼠腹腔注射100 μg Poly I:C（Poly I:C溶解于总量为200 μl的PBS中）；OVA肽+Poly I:C组：每只小鼠腹腔注射100 μg Poly I:C+200 μg OVA肽（溶解于总量为200 μl的PBS中）。7天后分别处死各组小鼠，取得脾组织。

1.2.2 T细胞刺激活化

研磨小鼠脾组织取得脾细胞混悬液，红细胞裂解液去除红细胞，300目滤网过滤，得到脾组织白细胞悬液；离心后重悬细胞，使其浓度为1×107个/毫升，接种于96孔板，每孔100 μl（1×106个细胞）。（1）研究非特异性T细胞：每孔加入PMA、Ionomycin刺激T细胞，PMA终浓度为50 ng/ml，Ionomycin终浓度为1 μg/ml；并加入golgi plug 4 微升/孔。96孔板放入细胞培养箱孵育12 h。（2）研究特异性CD8+T细胞（OVA）活化：每孔加入OVA肽刺激脾细胞，OVA肽终浓度为10 μg/ml；并加入golgi plug 4微升/孔。96孔板放入细胞培养箱孵育12 h。

1.2.3 细胞表面及胞内染色

取上述刺激活化的T细胞，以CD3、CD8、CD4、PD-1等抗体进行细胞表面染色；利用BD公司Cytofix/Cytoperm冰上避光孵育30 min，破细胞膜；加入IFN-γ-PE抗体进行细胞内染色，冰上避光孵育30 min。染色后采用A6流式细胞仪与Flowjo 7.6.1软件分析染色结果。IFN-γ+CD3+CD8+细胞即活化的CD8+T细胞；IFN-γ+CD3+CD4+细胞为活化的CD4+T细胞。

1.2.4 荷黑色素瘤小鼠免疫干预

取对数长期B16F10细胞，接种在20只C57BL/6雌性小鼠的右背外侧，每只接种5×105个B16F10细胞。10天后肿瘤生长至肉眼可见时，将20只荷瘤小鼠随机分成四组，分别为PBS组、CD8敲除组、Poly I:C组和Poly I:C +CD8敲除组。Poly I:C每隔5天腹腔注射一次，每只50微克/次，共注射3次。对照组在相应时间点腹腔注射等体积PBS。CD8敲除抗体分别在Poly I:C注射前2天、前1天及Poly I:C注射5天后进行腹腔注射，每只500微克/次。从第一次注射Poly I:C开始，每3天记录各组小鼠肿瘤的长径（L）和与之垂直的短径（W），并计算肿瘤体积（V=0.52×L×W2），当对照组小鼠肿瘤体积超过4 000 mm3时终止荷瘤实验。

1.3 统计学方法

所有实验均独立重复3次。采用GraphPad Prism 5.0统计学软件进行数据处理。t检验、Two-way ANOVA进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Poly I:C促进小鼠非特异性T细胞活化

脾细胞经PMA/Ionomycin刺激后，Poly I:C组活化的CD8+与CD4+T细胞百分比相对于对照组显著升高，见表1、图1A～B；Poly I:C组活化的CD8+与CD4+T细胞平均值也较对照组明显增加，见表1、图1C～D。

2.2 Poly I:C促进特异性CD8+T细胞活化

取对照组、OVA肽组、Poly I:C组、OVA肽+Poly I:C组的脾细胞，加入OVA肽段刺激，通过细胞内IFN-γ染色检测初次活化的OVA特异性CD8+T细胞数（IFN-γ+）。与Poly I:C组相比，OVA肽+Poly I:C组OVA特异性CD8+T显著增加，见表2、图2。

表1 PBS组与Poly I:C组活化的CD8+T细胞与CD4+T细胞及数量Table1 Number and percentage of activated CD8+T and CD4+T cells in PBS and Poly I:C groups

图1 Poly I:C促进PMA/ionomycin介导的非特异性T细胞活化Figure1 Poly I:C promoted PMA/ionomycin-mediated activation of nonspecific T cells

表2 Poly I:C对小鼠OVA特异性CD8+T细胞活化的影响Table2 Effects of Poly I:C on activation of OVA specific CD8+T cells

2.3 活化的特异性CD8+T细胞与非活化的CD8+T细胞PD-1表达差异

取OVA肽+Poly I:C组的脾细胞，加入OVA肽段刺激，检测初次活化的OVA特异性CD8+T细胞（IFN-γ+）与非活化的CD8+T细胞（IFN-γ-）表面PD-1表达差异。结果显示：IFN-γ+CD8+T细胞高表达PD-1，见图3。这一结果说明在OVA肽+Poly I:C免疫后7天，还在脾组织内，尚未向靶器官迁移的特异性CD8+T细胞已经开始表达PD-1。

2.4 Poly I:C显著抑制小鼠黑色素瘤生长

给予荷黑色素瘤小鼠PBS、CD8敲除、Poly I:C与CD8敲除、单用Poly I:C等方式干预，四组荷瘤小鼠肿瘤生长差异有统计学意义（F= 17.116,P＜0.0001），见图4。与对照组相比，Poly I:C组小鼠黑色素瘤生长明显减慢（F=7.8353,P=0.0243）；经CD8敲除后，Poly I:C的抗肿瘤作用被明显削弱（即Poly I:C+CD8敲除组vs.Poly I:C组：F=7.3425,P=0.0285）。

3 讨论

PD-1信号在T细胞衰竭过程中发挥重要作用。动物实验显示：肿瘤组织中大多数T细胞都是衰竭型T细胞，无法合成IFN-γ；阻断PD-1/PD-L1信号，可以抑制T细胞衰竭，促进部分肿瘤浸润T细胞合成IFN-γ[7]；因此，PD-1是T细胞衰竭的标志。然而,也有学者发现患者体内可识别自身肿瘤抗原的T细胞都表达PD-1，指出PD-1表达是预示T细胞能产生抗肿瘤免疫的标志[8-9]。考虑到PD-1表达可能具有不同效应，非常有必要研究PD-1是在T细胞活化后的哪个阶段开始表达及该阶段的T细胞功能。要解决上述问题，首先需要活化T细胞，并探索PD-1表达与T细胞功能性分子IFN-γ之间的关系。

图2 Poly I:C促进OVA特异性CD8+T细胞活化Figure2 Poly I:C promoted activation of OVA specific CD8+T cells

病原微生物介导的宿主T细胞活化机制为解决这一问题提供了新思路。当机体遇到免疫原性强的病原体感染时，可以快速有效激活天然免疫系统，促进特异性免疫应答，这一过程中，病原体相关分子识别模式（PAMPs）发挥关键作用。PAMPs指病原微生物所含有的某些高度保守的分子，这些分子可以和吞噬细胞（如树突状细胞、巨噬细胞等）表面的模式识别受体（PRR）结合，激活非特异免疫系统并提呈抗原，最终促进T细胞活化。PRR包括甘露糖受体、清道夫受体、Toll样受体（TLR）等；Poly I:C是TLR3配体，有研究报道Poly I:C可以促进树突状细胞表达CD80、CD86[10-11]。由于抗原提呈细胞表面CD80/CD86可以与T细胞表面CD28结合并为T细胞活化提供第二信号，因此Poly I:C具有促进T细胞活化的潜能，我们的实验结果也证实Poly I:C可以促进脾脏内特异性及非特异性T细胞活化。

我们的研究显示Poly I:C免疫后7天，脾组织内初次活化的特异性CD8+T细胞可以合成IFN-γ并高表达PD-1，且Poly I:C的抗肿瘤效应和CD8+T细胞有关。这一发现说明：（1）PD-1表达是早期事件，初次活化的、仍在外周淋巴器官内未向靶器官迁移的CD8+T细胞就已经开始表达PD-1；（2）脾组织内表达PD-1的CD8+T细胞是功能性的，可以合成IFN-γ，且Poly I:C的抗肿瘤效应与活化的CD8+T细胞有关；（3）进一步证实，在CD8+T细胞活化的不同阶段，PD-1表达具有不同的效应；外周淋巴器官内可以合成IFN-γ的CD8+T细胞高表达PD-1，说明PD-1也可以是T细胞的功能性标志。

图3 活化的OVA特异性CD8+T细胞(IFN-γ+)与非活化的CD8+T细胞(IFN-γ-)之间PD-1表达差异Figure3 Difference of PD-1 expression between activated OVA-specific CD8+T cells (IFN-γ+) and non-activated CD8+T cells (IFN-γ-)

图4 Poly I:C显著抑制荷黑色素瘤小鼠肿瘤生长Figure4 Poly I:C significantly inhibited tumor growth of melanoma-bearing mice