3-环己烯-1-甲酸的高效液相色谱手性分析

方钦虎



3-环己烯-1-甲酸的高效液相色谱手性分析

方钦虎

（浙江司太立制药股份有限公司，浙江 台州 317300）

目的研究3-环己烯-1-甲酸的高效液相色谱（HPLC）手性分析方法。方法正相条件下筛选3款常用的多糖衍生物型手性固定相并对分离结果进行优化。结果采用具有良好选择性的纤维素-三（4-甲基苯甲酸酯）涂覆型手性柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），在流动相为正己烷-异丙醇-三氟乙酸（体积比98∶2∶0.1），流速为0.5 mL·min-1，检测波长为200 nm的条件下可以基线分离3-环己烯-1-甲酸消旋体，并能准确地检测对映体的纯度。结论相比以往样品需衍生后再用HPLC分析的方法，该方法更加简单、高效。

药剂学；对映体拆分；高效液相色谱；3-环己烯-1-甲酸；手性分析；纤维素-三（4-甲基苯甲酸酯）

3-环己烯-1-甲酸是一种重要的化学试剂和有机合成中间体，被广泛应用于医药、化工等多个领域。如其衍生制得的1-[3-环己烯基-1-羰基] 哌啶和1-[3-环己烯基-1-羰基]-2-甲基哌啶可以作为驱虫剂[1]；在凝血因子Xa的抑制剂中，它是3,4-二氨基环己烷羧酸衍生物的重要起始原料[2]。

在医药中间体的合成中，多用到旋光活性的3-环己烯-1-甲酸为底物。工业上一般采用手性苯乙胺或萘乙胺对消旋体进行多步拆分，以得到单一对映体产品[2]。由于3-环己烯-1-甲酸的紫外吸收弱，其纯度检测一般采用气相方法。手性纯度检测时，则一般需要先衍生再分析，例如重氮甲基化成为甲酯后采用气相手性柱Chiraldex B-DM进行分析[3]；与手性2-甲基哌啶反应生成非对映异构体后用手性柱Chiralpak AS （流动相为体积比95∶5的正己烷-异丙醇）进行分析[4]。也有文献报道采用手性柱Phenomenex Chirex (S)-LEU & (R)-NEA（流动相为体积比85∶15∶5的正己烷-异丙醇-甲醇）对3-环己烯-1-甲酸和3-环己烯-1-甲酸甲酯进行手性纯度检测[5]，但对于保留时间的叙述不明确。

多糖衍生物型手性柱是目前最常用、选择性最广泛的一类手性色谱柱。其中结构为直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)和直链淀粉-三[()--甲基苄基氨基甲酸酯]的色谱柱可解决绝大部分手性样品的分离问题[6]。作者以前3种结构的手性柱进行了3-环己烯-1-甲酸的手性HPLC分析方法开发，以建立简单、快速、高效的检测方法。

1 仪器与材料

HPLC分析仪（配备Waters 515泵系统、7725i手动进样器、2489检测器，美国Waters公司）。手性色谱柱S-Chiral A、S-Chiral B与S-Chiral C的硅胶表面分别涂覆直链淀粉-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）、纤维素-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）与纤维素-三（4-甲基苯甲酸酯）（250 mm× 4.6mm，5μm，浙江华谱新创科技有限公司）。

3-环己烯-1-甲酸消旋体（浙江司太立制药股份有限公司），-对映体（手性纯度98.75%）与-对映体（手性纯度98.83%）（南京药石药物研发有限公司）。正己烷、异丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、三氟乙酸等试剂（色谱纯，百灵威科技有限公司），水为纯化水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：色谱柱S-Chiral A的硅胶表面涂覆直链淀粉-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）、S-Chiral B的硅胶表面涂覆纤维素-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）和S-Chiral C的硅胶表面涂覆纤维素-三（4-甲基苯甲酸酯）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：流动相组成见表1；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；检测波长：200 nm；进样量5 μL。

2.2 分离方法的筛选

精密称取消旋或手性3-环己烯-1-甲酸100 mg，置于25 mL量瓶中，用乙醇溶解并定容，制成质量浓度约为4 g∙L-1的乙醇溶液，按“2.1”条色谱条件进样分析，结果见表1。

系统死时间0由1,3,5-三叔丁基苯进行测定。保留因子00；分离因子21；分离度=1.18[(21)(12)]，其中1与2表示两峰的半峰宽。

实验中考察了正相与反相条件下，手性柱S-Chiral A、S-Chiral B和S-Chiral C对3-环己烯-1-甲酸消旋体的分离，具体结果见表1。

Table 1 Resolution result of racemic cyclohex-3-ene-1-carboxylic acid under various conditions

Note: *—Flow rate was 0.5 mL∙min-1

由于样品结构含有羧基，流动相中需要加入酸性添加剂来抑制其解离。而3-环己烯-1-甲酸的紫外吸收较弱，容易被流动相本底吸收掩盖，因此反相与正相流动相分别选择了紫外响应弱的磷酸与三氟乙酸作为添加剂。

反相考察了乙腈-体积分数0.1%磷酸体系与甲醇-体积分数0.1%磷酸体系。相同比例下，乙腈体系的洗脱能力较强，符合常规反相保留规律。但样品在S-Chiral A、S-Chiral B与S-Chiral C上均未得到有效分离。

正相考察了正己烷-异丙醇-三氟乙酸体系与正己烷-乙醇-三氟乙酸体系，二者为分析手性酸性样品的典型流动相体系。S-Chiral A与S-Chiral B仍未体现有效的对映选择性。但S-Chiral C的分离效果较好，且正己烷-异丙醇-三氟乙酸体系（条件11）下的分离因子（）与分离度（）较正己烷-乙醇-三氟乙酸体系（条件12）略高，即使后者的保留时间更长。流动相中异丙醇体积分数由5%降至2%，流速由1.0 mL∙min-1降至0.5 mL∙min-1（条件13）后，分离因子未明显变化，但分离度得到改善，接近基线分离，结果见图1。

A—V(hexane): V(isopropanol): V(TFA)=95∶5∶0.1, 1.0 mL∙min-1; B—V(hexane): V(isopropanol): V(TFA)=95∶2∶0.1, 0.5 mL∙min-1; 1—(S)-Cyclohex-3-ene-1-carboxylic acid; 2—(R)-Cyclohex-3-ene-1-carboxylic acid

2.3 分析方法的验证

以表1中条件13的手性柱S-Chiral C和流动相组成，按“2.1”条色谱条件对()-3-环己烯-1-甲酸对照品与()-3-环己烯-1-甲酸对照品进行分析，结果见图2、3。

1—(S)-cyclohex-3-ene-1-carboxylic acid(t=19.167 min, A = 1.2%); 2—(R)-cyclohex-3-ene-1-carboxylic acid (t = 20.169 min, A = 98.80%)

1—(S)-cyclohex-3-ene-1-carboxylic acid(t=19.045 min, A = 98.87%); 2—(R)-cyclohex-3-ene-1-carboxylic acid (t = 20.304 min, A = 1.13%)

结果表明，3-环己烯-1-甲酸的-构型对照品与-构型对照品的手性纯度分别为98.80%和98.87%，与产品标注的手性纯度98.75%和98.83%非常接近。表明该方法可以有效作为3-环己烯-1-甲酸的手性分析方法。

3 结论

经筛选，确定手性柱S-Chiral C即硅胶表面涂覆纤维素-三（4-甲基苯甲酸酯）（250 mm × 4.6 mm, 5 μm）对3-环己烯-1-甲酸具有良好的手性选择性。经优化，在流动相为正己烷-异丙醇-三氟乙酸（体积比98∶2∶0.1），流速为0.5 mL·min-1，检测波长为200 nm的条件下可以实现消旋体样品的基线分离。该方法可以准确地检测3-环己烯-1-甲酸样品的手性纯度。相比以往样品衍生后再分析的方法，其具有简单、高效的特点，更方便于产品的生产控制与质量检测。

[1] McGOVERN T P, SCHRECK C E, JACKSON J. Mosquito repellents: alicyclic amides as repellents for Aedes aegypti and Anopheles quadrimaculatus[J]. Mosq News, 1978, 38: 346-349.

[2] 苏州乔纳森新材料科技有限公司. 一种3-环己烯-1-甲酸的手性拆分方法: 201410682356.8[P]. 2015-03-25.

[3] KLUN J A, MA D, GUPTA R. Optically active arthropod repellents for use against disease vectors [J]. Journal of Medical Entomology, 2000, 37(1): 182-186.

[4] KLUN J A, KHRIMIAN A, MARGARYAN A, et al. Synthesis and repellent efficacy of a new chiral piperidine analog: comparison with Deet and Bayrepel activity in human-volunteer laboratory assays against Aedes aegypti and Anopheles stephensi [J]. Journal of Medical Entomology, 2003, 40(3): 293-299.

[5] TANYELI C, TURKUT E. Enzyme catalyzed reverse enantiomeric separation of methyl (±)-3-cyclohexene-1- carboxylate[J]. Tetrahedron: Asymmetry, 2004, 15(13): 2057-2060.

[6] 戴荣继, 王慧婷, 孙维维, 等. 高分子手性固定相的研究进展[J]. 色谱, 2016, 34(1): 34-43.

Chiral HPLC analytical method of cyclohex-3-ene-1-carboxylic acid

FANG Qinhu

(Zhejiang Starry Pharmaceutical Co., Ltd., Taizhou 317300, China)

Objective To develop chiral HPLC analytical method of cyclohex-3-ene-1-carboxylic acid.Method Undernormal-phase, three most useful chiral stationary phases based on polysaccharide derivatives were screened, and the resolution result was optimized. Result Chiral column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) coated with cellulose tris(4-methylbenzoate) exhibited a good selectivity. The cyclohex-3-ene-1-carboxylic acid racemate could be separated from the baseline with the mobile phase of hexane-isopropanol-trifluoroacetic acid (∶∶=98∶2∶0.1), flow rate of 0.5 mL∙min-1and the detection wavelength at 200 nm. The enantiomeric purities of ()- and ()-products were detected well. Conclusion This method is easier and more efficient compared with previous chiral HPLC analytical method which needs additional derivation.

pharmaceutics; enantiomer resolution;HPLC; cyclohex-3-ene-1-carboxylic acid; chiral analysis; cellulose tri(4-methylbenzoate)

2018-12-03

方钦虎(1965-), 男(汉族)，浙江台州人，工程师, 执业药师，学士，主要从事生产工艺优化与生产管理，Tel. 13967614427, E-mail zjstlfqh@163.com。

（2019）02–0028–05

10.14146/j.cnki.cjp.2019.02.002

R94；O657

A

(本篇责任编辑：赵桂芝)